MSX对细胞生长的影响——开题报告
（一）背景
近几十年来，单克隆抗体在医学研究、诊断和治疗方面越来越重要。由于这些大分子蛋白的生物学活性需要合适的翻译后修饰，而动物细胞中的翻译修饰与这些分子的天然修饰相似，因此动物细胞常用于单克隆抗体的表达，而产能不足是当前使用动物细胞生产单克降抗体遇到的重大问题。为了降低生产成本，需要提高抗体产量，可以通过改进基因转移和筛选方法得到高产细胞系。细胞筛选的过程就是挑选出产量高的细胞，并评估其稳定性。对于细胞加压筛选方向的研究有助于构建高产量的稳定的细胞株，可以丰富现细胞筛选的研究。
（二）细胞株的筛选
在高产稳定细胞系构建过程中，部分外源基因能够通过细胞质进入细胞核内，并通过分子间重组，最终整合进宿主细胞染色体，不同外源基因整合位点不同，只有整合到表达区的基因才会表达。而基因转染宿主细胞的质粒带有某种选择性标记（例如代谢标记、抗生素标记等），将带有标记的质粒转入宿主细胞后，利用选择性培养基进行筛选，未成功转染质粒或转染位点不合适的宿主细胞会因为缺乏选择标记，无法在选择培养基上生长而死亡，成功转染的阳性克隆可以在选择培养基上生长，从而达到筛选阳性克隆的目的。在细胞加压筛选过程中，还会对转染后的宿主细胞施加相应的选择压力，只有外源基因表达水平高的细胞株才可以存活，从而筛选得到高表达的稳定细胞株。
（三）GS筛选系统与L-氨基亚砜蛋氨酸（Methionine Sulphoximine ,MSX)
GS 筛选系统（glutamine synthetase Gene Expression System）即谷氨酰胺合成酶基因表达系统，是新近发展的更有效率的扩增表达系统。谷氨酰胺合成酶能将谷氨酸和氨合成为谷氨酰胺，这种酶促反应是动物细胞获得谷氨酰胺的途径。大多数哺乳动物细胞内源的谷氨酰胺合成酶活性很低，而且通过化学诱变获得的GS 缺陷型细胞株不能在不含谷氨酰胺的培养基中生长，需要在培养基中额外添加谷氨酰胺细胞才能生长，除非它被含有 GS 表达原件的载体转染后获得了有活性的 GS，通过向培养有 GS 重组细胞的培养基中添加浓度不断提高的 GS 抑制剂 L-氨基亚砜蛋氨酸（Methionine Sulphoximine ,MSX)，这种选择性压力可使细胞发生基因重排和扩增。通过多轮筛选，可获得高表达的细胞株。并且该系统由于应用氨和谷氨酸合成谷氨酰胺供细胞利用,因而可以极大地降低培养基中氨的浓度。而高浓度的氨已被证实是引起细胞凋亡的一个原因。所以应用GS加压系统进行外源基因的扩增,有利于细胞的大规模培养。
因此MSX是细胞压力筛选过程中的关键物质，在生产过程中是否需添加及添加量都需要进行研究，合适的MSX加入量能使细胞加压筛选这一过程得到最大化的利用，有利于筛选出生产型稳定的细胞株，从而获得较高的预期产物量。在药物生产过程中，可以降低生产成本，提高抗体产量，解决当前使用动物细胞生产单克隆抗体遇到的产能不足的重大问题。
（四） 实验设计
首先，按标准的操作规程配制培养基，培养的物料为CD培养基干粉和MSX，培养基配制时，按一定顺序对MSX的加入量做出改变，得到MSX含量不同的培养基，接着选取来源相同的CHO细胞在所得培养基中分别复苏，复苏后的CHO细胞分别继续在各自MSX浓度的培养基上培养，在细胞接种后十天内每隔一天取样检测细胞数，得到不同浓度MSX培养基内的细胞数。最后，归纳十天内MSX加入量的变动对所得细胞株的细胞数目的影响，得到相应的细胞数目随MSX变化的模型，最终得到最适的MSX加入量。注意：在实验过程中，要严格遵循控制变量的方法，保持其他变量完全一致，仅使MSX的加入量发生变动。
