新型小分子抗肿瘤免疫药物药理活性的初步探索
- 课题研究背景
随着肿瘤分子生物学和肿瘤免疫学等相关学科的迅速发展，肿瘤的免疫治疗已成为继传统治疗方法如手术、放疗和化疗后的一种新的治疗方法。为了发挥肿瘤免疫治疗的最佳疗效，人们有必要对影响免疫治疗效果的肿瘤免疫耐受机制有一个清楚而全面的认识。研究表明吲哚胺2，3-双加氧酶1(indoleamine2,3-dioxygenase1,IDO1)介导的肿瘤免疫耐受已成为研究热点。继而对于IDO1抑制剂的研究与应用成为重中之重。IDO抑制剂作为具有新药靶、新机制的药物，可应用于治疗肿瘤、阿尔茨海默病、抑郁症、白内障等多种重大疾病。本课题采取几种新型IDO1抑制剂展开体内，体外实验，对药物药理活性进行初步探索。
- 国内外研究历史及现状
IDO1，全名是吲哚胺2,3-双加氧酶1。IDO1是亚铁血红素的单体酶，是肝脏以外惟一可催化色氨酸代谢，使其沿犬尿氨酸途径分解生成包括喹啉酸在内的一系列代谢产物的限速酶。ID01有2个同工酶，即色氨酸双加氧酶(TDO)和吲哚胺2,3-双加氧2(ID02)。TDO在多种肿瘤的免疫逃逸中起一定作用，而ID02在T细胞对肿瘤抗原的免疫耐受中的角色和机制还有待深入研究。
IDO1在正常状态下表达水平较低，在炎症或感染过程中表达显著增加，此外脂多糖及细胞因子等均可诱导IDO1的表达。体外研究发现，除犬尿氨酸外，色氨酸的中间代谢产物3-羟基邻氨苯甲酸和喹啉酸也可在体外诱导小鼠胸腺细胞和T淋巴细胞凋亡。肿瘤细胞可通过消耗局部色氨酸，产生的代谢产物诱导局部免疫，同时肿瘤局部浸润性T淋巴细胞水平明显下降。在炎症反应中，多种炎症细胞因子尤其是IFN-gamma;能够诱导IDO1的表达，加速L-Trp的代谢，IDO1作为免疫应答的一部分，通过消耗病原体生长所必需的色氨酸，保护宿主免于病原体的感染。而在肿瘤组织中，肿瘤细胞也能利用IDO1的这一功能，抑制机体的免疫应答反应。1DO1主要通过GCN2、m-TOR和AhR这3种机制介导体内免疫抑制功能。因此，在过度表达IDO的肿瘤组织以及肿瘤引流淋巴结中，都会产生一个免疫抑制的肿瘤微环境，使T细胞一进入肿瘤组织就被抑制。IDO1在抑制T细胞的同时，还对肿瘤细胞的血管生成有一定的影响。血管生成，是生殖、发育和组织修复的必要条件。异常的血管生成与许多疾病密切相关。在肿瘤微环境中，许多细胞因子，转化因子，如IL-10，IL-6，TGF-beta;，TNF-alpha;等，都以VEGF有影响。IL-6是STAT3通路的主要激活剂之一。而STAT3通路在多种人类恶性肿瘤中表达异常。IL-6通过促进磷酸化STAT3的表达，激活STAT3通路。当这条通路被持续激活时，它下游的VEGF的表达将会上调。有研究表明，IDO在色氨酸代谢途径中，通过消耗色氨酸产生犬尿酸可以增加组织中IL-6的表达，从而增加VEGF的表达，促进肿瘤血管的生成。因此可以说，IL-6是连接着IDO与肿瘤血管之间的桥梁。IDO通过增加IL-6的表达，使VEGF表达上调，从而促进肿瘤的血管生成。虽然IDO是机体重要的免疫哨卡之一，但并不是唯一。肿瘤细胞同样会通过其他途径逃逸。因此，单独使用IDO抑制剂治疗肿瘤，往往效果有限。所以，IDO抑制剂与其他疫苗或者免疫检查点抑制剂，如PD-1抑制剂联合应用，使它们协同作用，提高治疗效率，将是药物开发的一个趋势。
目前大多数IDO1抑制剂都处于临床研究阶段，有几个药物已经到了临床二期或三期，很快将会上市。比较熟知的IDO1抑制剂包括：Newlink Genetics的indoximod ，Incyte公司的epacadostat，BMS公司的BMS-986205等。
- 课题研究目标及主要内容
CD4 亚群（Th细胞）根据自身所分泌的细胞因子,分为Th1，Th2，Th17及Treg等细胞亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN- gamma;和TNF-beta; 等细胞因子。Th1细胞主要介导细胞免疫反应,在诱发器官特异性自身免疫病,器官移植排斥反应和抗感染免疫中起着重要的免疫调节作用。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。Th2细胞主要调节体液免疫反应,在诱发过敏反应中起着决定性的作用。Treg是免疫微环境中发挥免疫抑制的主要细胞类型之一，前期研究表明，IDO1的上调可以明显引起肿瘤微环境中CD4 Foxp3 Treg细胞的上调。因此，本课题以Th1， Th2及Treg三种亚群作为主要研究对象，以IDO1抑制剂如INCB,1-MT为阳性药，研究不同IDO1小分子抑制剂JQID050, JQID021, JNST等对各种细胞分型比例的调节作用，完成体外药理活性的初步研究。首先通过细胞增殖实验，参照文献中阳性药的给药浓度，确定各种药物的对小鼠路易斯肺癌LLC细胞的最适给药浓度。T细胞与LLC细胞在各种药物的作用下共孵育，研究药物对T细胞不同分型的影响及共孵育上清中各种细胞因子的变化情况，从而得到对药物在体外对T细胞分型的简单调控模型。主要研究手段包括免疫细胞分离纯化，质粒载体构建，CRISPR-Cas9, 蛋白质免疫印迹等。
- 课题进度安排
2019年03月，根据查阅的文献，选定合理给药条件和进行预实验从而确定研究方法，构建好目的载体等基础材料，做好准备工作；
2019年04月-05月，进行体外及体内实验，研究IDO1抑制剂在TAM下影响情况，分析小分子抗肿瘤免疫药物的药理活性；
2019年05月，对实验数据进行处理和总结，在此基础上撰写研究论文和研究报告。
