姓名

袁胤

学号

16404529

专业

生物制药

指导教师

高向东

课题名称

多功能转铁蛋白-阿霉素复合物的制备、表征及其抗肿瘤活性的初步研究

课题性质

基础研究 radic; 应用课题 设计型 调研综述 理论研究

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

开题报告

一．课题的来源与选题的依据

目前，癌症已成为人类健康安全的最大杀手之一，根据世界卫生组织报告，全球在2015年由癌症导致的人员死亡可达880万人，占了全球死亡人数的六分之一^[1]。虽然随着科学的进步，人们对癌症的了解进一步加深，但人类仍旧未能对癌症完成彻底的征服。传统的癌症治疗药物——化疗药物，虽然对癌细胞有很大的杀伤作用，但其选择性较差且具有较大的毒副作用^[2]。除此之外，长期使用化疗药物还会使机体产生耐药性^[3]。因此，找到合适的药物靶向输送系统，以药物实现对肿瘤细胞的特异性杀伤，同时一定程度上缓解耐药性成为目前癌症治疗领域的一个热点^[4]。

据研究报道^[5]，随着人们对金属药物和金属配合物的逐步深入研究，越来越多的金属基分子和材料应用于医药领域和临床研究中，铁蛋白就是其中重要的一种。铁蛋白是一种单一分散、尺寸规整且具有对称性的笼状结构蛋白，天然存在于人体中，由24个亚基自组装而成，其外径12nm，内径为7~8nm，已被验证可包裹多种化疗药物^[6,7]。更重要的是，研究者们还发现人重铁蛋白（HFn）还可以于大多癌细胞中过表达的转铁蛋白受体1（Tfr1）特异性结合，因而HFn可以作为一个潜在的靶向输送系统应用于药物开发中。例如，HFn纳米笼可以携带高剂量的阿奇霉素（DOX），并通过与Tfr1特异性相互作用识别肿瘤细胞，借助受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞，再通过溶酶体释放，实现杀特异性伤肿瘤细胞的作用^[8,9,10]。

天然HFn作为一种天然存在于人体内的金属蛋白，在生物相容性、可调性和稳定性方面均表现优异。用其作为药物靶向输送载体的优势如下：①固有的肿瘤靶向能力：不需要任何配体修饰，HFn可以通过Tfr1介导的靶向和随后的受体介导的内吞作用，将Dox特异性地传递到肿瘤细胞中^[11]；②良好的药物动力学特性和安全性：HFn在人体中自然存在，不含有任何潜在的毒性元素，在体内使用时表现出良好的生物相容性。此外，HFn纳米粒子的尺寸为12 nm，是抗肿瘤纳米医学的理想材料，因为它能完全克服肿瘤微环境所带来的生理障碍，并能主动深入肿瘤组织^[12];③便于生产：天然HFn在大肠杆菌中有较高的收率，同时其耐热的性质更便于纯化^[13]；④良好的抗肿瘤活性：HFn包裹DOX形成复合物后可以提高药物半衰期，同是显著降低毒性^[11]；⑤高载药量：HFn纳米粒子可以包裹大量外来分子^[14]。这些优良的性质让HFn成为抗癌药物靶向递送的优良载体。

尽管HFn载体有诸多优点，但有研究表明未修饰的HFn携带DOX血浆半衰期较短（约两个小时），大大限制了它的临床引用^[15]。而为了进一步增强药物的疗效和降低毒性，临床上通常将药物进行PEG修饰^[16]，这不仅能够延长药物半衰期，还能通过EPR效应被动靶向至肿瘤组织，降低正常组织中的聚集从而降低毒副作用，同时能够增加药物在肿瘤部位的分布。虽然PEG的毒性被认为很低，但长期的给药后还是会造成肾毒性。不过，PsTag的出现解决了这一问题，它是由实验室开发的一种PEG模拟技术，由数种人工设计的低免疫原性短肽非重复组合而成，其除了具有PEG的优势外，还可以在体内生物性降解，同时其序列可编码，是一种安全高效的生物药物长效化技术。

本课题组在前期研究中构建的一种新型融合蛋白PAK,具有长效且肿瘤靶向释放的特点^[17]。它可以利用EPR效应被动靶向至肿瘤组织处^[18],并在肿瘤微环境中被肿瘤细胞高表达的MMP2酶实现活化^[19,20],完成对肿瘤细胞的杀伤。PAK分子的药理作用正在于利用靶向释放其内部的KLA结构域破坏线粒体膜，导致原本存在于线粒体内的细胞色素C渗漏并诱导细胞凋亡^[21]。而相关研究表明，肿瘤细胞的耐药性由线粒体诱导产生^[22,23,24]。因此，PAK在发挥抗肿瘤作用的同时，可能还是克服化疗耐药的候选分子。

结合以上研究，并基于肿瘤治疗的目前所面临的的有效性问题，我们希望通过PAK分子和转铁蛋白重组形成融合蛋白PAK-HFn，并包裹DOX形成一种双功能的、靶向释放的新型PAK-HFn/DOX复合物，同时发挥KLA和DOX的抗肿瘤作用，以此作为肿瘤治疗的一种新型候选分子。

PAK-HFn/DOX作为一种新型纳米药物，具有以下优势：①载药量高：每个HFn载体上可精确修饰24个PAK分子并至多装载约400个DOX分子^[25]，实现肿瘤组织的高剂量药物递送；②药代动力学和稳定性的提高：PAK中的聚多肽基序不仅可延长复合物的血浆半衰期，还可通过空间屏蔽效应提高负载DOX的稳定性；③靶向性好：HFn提供的主动靶向和纳米粒子的被动靶向组成了PAK-HFn/DOX复合物的双重靶向，极大地提高了药物的递送效率，同时降低了药物在正常组织的蓄积；④双功能协同克服耐药：HFn载体可同步将阿奇霉素和PAK递送至肿瘤细胞，由PAK对线粒体的损伤可增加DOX对耐药性细胞的毒性，实现对耐药肿瘤的协同治疗。因此，PAK-HFn/DOX具有传统化疗药物或治疗性多肽无法比拟的优势。

综上所述，本课题将首先通过分子构建，得到包含PAK-HFn融合蛋白序列的质粒，并转染至E.coli表达菌株BL21(DE3)中进行该融合蛋白的表达和纯化。在得到该蛋白的基础上，利用HFn的生物学性质包裹阿奇霉素形成PAK-HFn/DOX复合物，并进一步完成对该复合物进行理化性质鉴定和逆转耐药活性的初步研究。

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二．技术路线

三．实验方案

1. 融合蛋白PAK-HFn的制备

1.1. 融合蛋白的设计与表达：以本实验室前期合成的PAK为基础，重新设计引物，将退火后的引物与酶切后的载体相连，转化进入大肠杆菌，通过卡那霉素抗性筛选及测序验证鉴定获得含有表达目的基因的菌体，保存以备后续使用。构建好工程菌后，对转化好的菌种进行扩大培养，培养到对数生长期后采用IPTG进行诱导，使目的蛋白大量表达。

1.2. 融合蛋白的纯化：

1.2.1. 离心收集菌体；

1.2.2. 超声波破碎取菌液上清；

1.2.3. Q阴离子交换树脂纯化蛋白；

1.2.4. Ni柱亲和层析；

1.2.5. 纯化后蛋白-20°C冻存备用。

1.3. 融合蛋白的验证：对已纯化后的蛋白分别进行SDS-PAGE电泳及Western Blotting检测，根据其条带结果判断是否成功获得了目的蛋白。

2. PAK-HFn/DOX复合物的制备

尿素组装：取蛋白样品加入8M尿素中，调节pH至中性，接着加入DOX包裹形成复合物分子，再通过透析除去尿素。然后利用AKTA纯化系统将制备好的转铁蛋白阿霉素复合物通过脱盐柱Sephadexensp;G-25进一步纯化，再通过超滤浓缩得到最后的成品。随后借助Bradford法测定成品蛋白的浓度，并通过SEC-HPLC验证了转铁蛋白是否组装成功。

1. PAK-HFn/DOX复合物物理化学性质鉴定
   1. 透射电镜：观察复合物的形态和均一性；
   2. 载药量测定：先通过酶标法测定样品内DOX浓度，再采用Bradford法测定蛋白浓度，计算得出载药量；
   3. RP-HPLC：测定产品纯度
   4. 圆二色谱法：测定融合蛋白的二级结构
   5. 稳定性：37°C小鼠血清中孵育，评价复合物的稳定性，并用HPLC检测
2. PAK-HFn/DOX复合物的药用活性研究

细胞系的选择：正常细胞（L02、HEK293）、一般肿瘤细胞（A375、A579、Hela、HepG2、BGC823、MCF-7）、化疗耐药细胞（MCF-7/ADR），比较PAK-HFn/DOX复合物对各个细胞系细胞毒性和选择性；

MMP2鉴定：多种浓度MMP2酶与PAK共孵育4小时，采用SDS-PAGE、RP-HPLC、MALDI-TOF/MS对共孵育产物进行鉴定，考察PAK-HFn/DOX复合物是否能在体外被MMP2酶切割；

Tfr1鉴定：将复合物与过表达Tfr1的A375细胞进行孵育，孵育后对A375细胞进行流式细胞术检测，考察复合物的结合活性；

MMT细胞毒实验：MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。借助MMT细胞毒试验初步鉴定转铁蛋白阿霉素复合物的抗肿瘤活性；

1. 预期目标

1. 功获得新型抗癌复合物药物，实现该药物能高特异性杀伤肿瘤细胞的作用，为肿瘤治疗提供候选分子。

2. 申请发明专利1项。

1. 论文研究的意义和创新点

本项目以高效递送及选择性释放KLA及DOX协同发挥杀伤肿瘤细胞为目标，开发新型长效高特异性蛋白药物复合物并初步研究其对肿瘤细胞的杀伤作用，对肿瘤的个性化治疗具有潜在的临床应用前景。

1. 实验中预计的技术难点和解决方法

1. 本课题利用融合蛋白PAK-HFn包裹阿奇霉素实现对肿瘤细胞的靶向治疗，但前期融合蛋白的能否正确表达和表达量的增加是本课题的一个难点。为了解决这一问题，可以合理调节宿主菌的生长条件，选择最佳的融合蛋白表达条件，以获取较高的蛋白表达量。

2. 本课题利用多功能转铁蛋白阿奇霉素复合物的双功能协同作用克服肿瘤细胞耐药性，但PAK是否能达到克服耐药性的作用仍需研究。为了解决这一问题，本课题将比较复合物对耐药细胞与通常肿瘤细胞的杀伤活性，以确定该复合物是否能克服肿瘤细胞耐药性。

1. 实验进度安排

2020.03—2020.04 文献调研，实验设计

2020.04—2020.05 融合蛋白PAK-HFn的构建、表达和纯化

2020.04—2020.05 PAK-HFn/DOX复合物的制备

2020.05—2020.06 PAK-HFn/DOX复合物理化性质鉴定

2020.05—2020.06 复合物抗肿瘤活性初步研究

2020.06 实验补充，实验数据整理，完成毕业论文

1. 文献综述

铁蛋白在治疗诊断方面作为天然或人工纳米酶

摘要：纳米酶是一类具有固有类酶特性的纳米材料，克服了天然酶的成本高、稳定性低、大规模制备难度大等缺点以应用于大规模制剂。纳米酶将化学催化剂和天然酶的优点结合在一起，在生物医学应用中表现出巨大的潜力。然而，尺寸可控的合成和目标纳米酶的修饰的研究仍然具有挑战性。在这里，我们介绍铁蛋白纳米酶来解决这些问题。铁蛋白是天然的纳米酶，具有固有的类酶活性（例如氧化酶、过氧化物酶）。此外，通过生物合成铁蛋白壳内的纳米酶，以介绍人工铁蛋白纳米酶，它具有多功能自组装铁蛋白的优点和纳米酶的酶活性。铁蛋白纳米酶为纳米酶在疾病靶向治疗研究中的发展提供了新的视野。铁蛋白纳米酶的出现也激励我们借鉴天然纳米结构来优化或合理设计纳米酶。本文综述了铁蛋白的内在酶活性和铁蛋白纳米酶的生物工程合成。那之后，对铁蛋白纳米酶的应用进行了综述。最后，讨论了先进铁蛋白纳米酶在生物医学研究中的优势、挑战和未来的研究方向。

关键词：铁蛋白；纳米酶；治疗诊断

1. 引言

2007年在第一次报道表明铁磁性（Fe₃O₄）纳米粒子具有本征过氧化物酶样活性后^[1]，纳米酶特异指具有固有类酶特性的纳米材料（图1）。纳米酶能在温和条件下催化天然酶的底物，具有与天然酶相似的催化能力和反应动力学^[2]。与天然酶相比，纳米酶具有更高的催化稳定性、更经济且更容易大规模制备^[2,3]。除此之外，铁蛋白还具有纳米材料的固有特性。例如光学特性、磁学特性、热学特性以及其他，这使它能够被设计成适合于特定的生物微环境和外部刺激^[4]。纳米酶比天然酶的优势吸引了许多致力于纳米酶研究领域的科学家。此后，新出现的研究表明，各种纳米材料（如金属和金属氧化物纳米粒子、碳纳米粒子、金属-有机骨架(MOFs)以及其他）具有类似酶活性^[5]。纳米酶被认为是一种新材料和下一代人工酶，并且，纳米酶的概念已广泛为人所接受。来自30个国家的超过350个研究室正在研究纳米酶，并且由49种单体合成的超过540种纳米酶已经被报道（图1）。通过连接纳米技术和生物学，纳米酶已经成为治疗疾病热疗策略的新的有前途的药物^[6]。

然而， 纳米酶的尺寸可控合成和靶向修饰在热学应用中仍然具有挑战性。通常，纳米酶的酶样活性是大小依赖性的。尺寸越小，纳米酶的比表面积越大，纳米酶的相对酶样活性越高^[1]。因此，纳米酶的尺寸可控合成对于稳定纳米酶的热敏效应具有重要意义。 此外，当纳米酶用于疾病靶向治疗时，纳米酶通常会被靶向基序化学修饰，如抗体^[7]。这种化学偶联过程是可行的，前提是纳米酶在其表面具有酰胺基、羧基或巯基。 然而，一些纳米酶（如普鲁士蓝）不可用于化学基团修饰^[8]。此外，这些化学共轭物需要复杂的多步化学反应和昂贵的试剂^[9]。因此，目标纳米酶的修饰需要新的策略。

铁蛋白纳米酶的出现为解决这些挑战提供了一种很有前途的策略。 铁蛋白是一种由有机和无机成分组成的天然纳米材料，具有恒定的纳米腔和固有的类酶活性用于生物反应。因此，铁蛋白可作为纳米酶载体或反应器，用于纳米酶的尺寸可控合成。此外，铁蛋白纳米颗粒具有被动和主动的肿瘤靶向能力，已被广泛应用于肿瘤靶向治疗^[10,11]。在最近的研究中，我们发现铁蛋白可以通过识别在肿瘤中高表达的转铁蛋白受体1(TfR1)来靶向肿瘤组织^[9,12-15]。利用铁蛋白的生物矿化过程，我们在铁蛋白腔内合成了不同类型的金属氧化物纳米酶，其尺寸受限^[12,16,17]。因此，铁蛋白纳米酶可用于肿瘤靶向治疗。通过遗传或化学方法，我们对含有靶向基团的铁蛋白纳米粒子进行了改性，使其具有不同的靶向性^[16]。铁蛋白纳米酶具有尺寸均匀、靶向性可改变、相容性好等优点，因此铁蛋白纳米酶是尺寸可控合成和纳米酶靶向修饰的极好策略。

图1：在2019年8月底之前，科学网包括的关于纳米酶研究的发表论文数量。到目前为止，已有49多种元素被用于合成纳米酶。

在此，我们系统地介绍了铁蛋白纳米酶的概念和发展，以及铁蛋白纳米酶的最新研究进展。本文详细地综述了铁蛋白、铁蛋白作为纳米反应器制备各种尺寸受限的纳米酶的天然酶活性，并赋予纳米酶不同的靶向性和铁蛋白纳米酶癌细胞的靶向生物医学应用。最后，本文讨论了未来探索的挑战和展望。我们期望通过学习铁蛋白生物矿化过程的途径以在铁蛋白纳米材料中找到合成不同种类纳米酶的规则。此外，我们还期望设计新的铁蛋白纳米酶，以更好地适应复杂的生物微环境和对特定刺激的智能响应。

1. 铁蛋白作为天然纳米酶
   1. 铁蛋白的结构

铁蛋白是一种球形铁储存蛋白，广泛存在于生物体内。1937年，铁蛋白首先从马脾中分离出来^[18]，从那时起，铁蛋白在人类、动物、植物、真菌和细菌中被发现^[19]。不同物种铁蛋白的氨基酸序列差异很大，而蛋白质结构保持一致^[20]。 自然地，24个铁蛋白亚基自组装成球形蛋白笼，内径和外径分别为8nm和12nm（图2）。铁蛋白笼以铁芯的形式包裹多达4500个Fe³ 原子进入其腔内。铁蛋白的铁心由一种磷酸铁氧氢氧化物组成^[21]。典型地，磷酸包含于复合物已被解决当通过热处理或变性处理将其从蛋白质笼中分离出来，其余产物为铁水化合物，5Fe₂O₃·9H₂O^[22]。在去除位于空腔内的矿物核后，我们可以得到铁蛋白外壳，称为去铁铁蛋白。

铁蛋白的每个亚基由四个长螺旋、一个短螺旋和一个长环组成^[20]。每个亚基的N端暴露在铁蛋白纳米粒子的外表面，而C端折叠在内腔中^[19]。铁蛋白纳米粒子具有六个C4通道和八个C3通道，形成铁蛋白笼的对称结构^[22]（图2）。该C3通道具有亲水性，允许金属离子，如Fe² 离子和H2O分子进入腔内。C4通道具有疏水性，允许O₂或小的有机分子进入空腔^[20]。

图2：铁蛋白的结构。铁蛋白是一种24亚基低聚物，由H亚基（铁酶位）和L亚基（成核位点）组合而成，自组装成球形对称蛋白质外壳，内径和外径分别为8nm和12nm。 蛋白壳上形成8个亲水通道和6个疏水通道。在腔内合成了铁氧体核 (PDB entry 5N27)。

铁蛋白亚基通过疏水相互作用自组装成球壳^[20]。亚基内部有许多氢键和盐桥^[23]， 因此，铁蛋白即使在高温环境下也保持稳定，并能耐受许多变性剂，如盐酸胍和尿素。在高浓度盐酸胍(6M)或尿素(8M)条件下，铁蛋白外壳被拆卸。除去这些变性剂后，铁蛋白亚基将重新组装成蛋白质外壳^[24]。在极端酸(pH2-3)或极端碱性(pH10-12)的环境下，铁蛋白解体。当它恢复到生理环境时，铁蛋白亚基也会重新组装成蛋白质外壳^[25]。铁蛋白的这些特性使其成为用于生物医学应用的纳米载体或纳米反应器的有用平台。 哺乳动物铁蛋白和人类铁蛋白一样，通常由两种不同类型的亚基组成，即H亚基和L亚基（图2）。其中H-亚基和L-亚基的分子量分别为21kda和19kda。 有证据表明，H-亚基和L-亚基在人类铁蛋白铁储存机制中具有协同作用^[26]。

• 1. 铁蛋白壳层表现出类似铁酶的活性

事实上，铁蛋白作为一种天然的纳米材料也是一种纳米酶，具有类似铁酶的内在活性。1973年，马脾载铁蛋白(HSAF)具有催化活性，以分子O₂为电子受体催化Fe² 向Fe³ 的氧化而其他蛋白没有这种效果^[27]。不久之后，据报道，铁蛋白H亚基含有一个铁酶位点^[28]，它催化亚铁离子迅速氧化成铁，而L亚单位则没有。L-亚基在铁氧基酶位上促进铁氧化，一旦超过铁氧基酶位的铁结合能力，就促进矿物表面的氧化，从而L-亚基的促进了铁水化合物的成核^[29]。 因此，在哺乳动物铁蛋白中，富含H亚基的铁蛋白具有快速的铁掺入速率，可快速催化有毒Fe² 氧化为无毒Fe³ ，适用于高代谢活性组织，如心脏和大脑。而富L亚基铁蛋白则表现出较低的铁掺入率，但储存更多的铁。这一特点见于富含铁的组织，如肝脏和脾脏。

由于铁蛋白H亚基具有较高的类铁酶活性，铁蛋白内铁核的形成速度远快于无蛋白条件下氧化铁的形成速度^[20]。人类H亚基的铁酶位点主要由三个氨基酸残基组成(Glu 27, Glu 62, His 65)^[30]（图3A）。这三个残基在大多数已知的来自不同物种的H-亚基序列中是保守的，但在L-亚基序列中是不存在的^[19]。据报道，铁蛋白H亚基在两个氨基酸残基E62K 和H65G 突变后失去了类似铁酶的活性（用L-亚基氨基酸取代62和65的H-亚基）^[30]。后来，在1996年，Harrison和Arosio提出了一种二铁氧基酶中心模型，表明铁氧基中心有两个铁结合位点(Fe_A和Fe_B)^[20]，并且结果表明，内表面氨基酸残基Glu62、Glu107、Tyr34、Gln141在铁酶中心形成第二铁结合位点(Fe_B)^[31]。 此外，据报道，Gln58还可能具有铁结合能力^[32]（图3B）。此外，位于铁酶位点附近的人铁蛋白H亚基的内表面Glu残基有助于铁心的沉积，这一结果表明，铁蛋白H亚基铁氧酶位点和内表面Glu残基的突变导致铁氧化和核化完全消失^[33]。

从细菌铁蛋白等微生物中分离出的铁蛋白与人类铁蛋白H亚基相似，亚基分子量约为20kDa^[19]。 这些铁蛋白还具有铁酶位点，如人铁蛋白H亚基，可催化Fe² 氧化生成Fe³ ，并将铁储存在铁蛋白的腔内^[34]。

铁蛋白纳米粒子内部铁核形成的可能过程包括4个步骤^{[20, 22, 28,29, 31, 35, 36]}。

1. 通过铁蛋白壳层的Fe² 离子。由于C3通道在铁蛋白纳米粒子表面的亲水性，Fe² 离子可以通过铁蛋白纳米粒子自由进入铁蛋白纳米粒子的腔内的C3通道，然后移动到铁酶位点。
2. Fe² 离子氧化。在到达铁蛋白H亚基的铁氧酶位点后，Fe² 离子与铁氧酶催化位点结合，然后在O₂存在下发生氧化，导致H₂O₂的生成^[36]。

Protein 2 Fe² O₂ 3 H₂O → Protein-[Fe₂O(OH)₂]² H₂O₂ 2 H . (1)

1. 氧化的Fe³ 原子移动到空腔的成核中心，水解并形成矿物核^[35]。

Protein-[Fe₂O(OH)₂]² H₂O → Protein 2FeOOH_(core) 2 H . (2)

1. 铁心核一旦达到100个或更多的Fe³ 离子，Fe² 离子就会在H₂O₂存在下直接氧化并沉积在矿物核表面^[35]。 因此，随着Fe² 和H₂O₂的消耗，矿物核心的尺寸不断增大。最后，在铁蛋白腔尺寸的限制下，形成了一个稳定的铁水化合物。

2 Fe² H₂O₂ 2 H₂O → 2 FeOOH_(core) 4 H . (3)

图3：铁蛋白H亚基的铁酶位点。（A）重组H亚基铁蛋白中拟议的铁氧酶中心。经允许转载^[30]。 2015年欧洲生物化学学会联合会。（B）铁蛋白H亚基氧化还原酶在铁自由扩散到晶体1min后的电子密度。经允许转载^[32]。 版权所有为2015国际结晶学联盟。

• 1. 天然分离的铁蛋白显示出其他类似酶的活性

铁蛋白通过发挥其类似铁酶的活性，在抗氧化和解毒代谢中起着重要作用^[31]。一些研究还表明，除了铁的结合和类似铁酶的活性外，铁蛋白还表现出类似过氧化物酶的活性^[37-41]， 这可能赋予铁蛋白更多的调节氧化还原代谢的功能。1997年，Arapova，G.S.等人首次发现马脾铁蛋白具有内在的过氧化物酶活性，20度的条件下，在H₂O₂存在时，可催化3,3rsquo;,5,5rsquo;-四甲基联苯胺(TMB)，正固醇和邻苯二胺(PDA)氧化^[37]。2011年，Tang等人还证实了这一现象，证明马脾铁蛋白催化TMB、邻苯二胺(OPD)、N,N-二甲基对苯二胺(DPD)(图4A)，羟基苯丙酸(p-HPPA)和鲁米诺(图4B) 的氧化，在50℃H2O2存在下15分钟的条件下^[41]。他们发现，即使在高温（80℃以上）或极端酸性环境(pH2.0)下，马脾铁蛋白仍表现出较高的过氧化物酶活性。马脾铁蛋白过氧化物酶活性的热稳定性和耐磷性优于辣根过氧化物酶(HRP)(图4C)。 2012年，Violetta Borelli等人报告说，以人肺铁蛋白为主要蛋白质成分的铁体具有类过氧化物酶活性^[40]。这些研究表明，从不同香料中分离出的天然铁蛋白具有内在的过氧化物酶活性^[37-41]。

有趣的是，Arapova，G.S.等人表明，热失活和洗涤剂处理后铁蛋白的过氧化物酶活性降低，这表明：铁蛋白活性来源于铁蛋白壳层^[37]。而Tang等人的研究表明，马脾铁蛋白的过氧化物酶样活性来源于其铁纳米颗粒，而不是铁蛋白壳^[41]。铁蛋白、铁核或蛋白壳的哪个成分负责过氧化物酶活性需要进一步澄清。铁蛋白的这些催化活性来源于蛋白质壳层或铁核，激励我们利用铁蛋白作为纳米反应器或纳米载体，通过发挥其钙来应用于生物医学领域。

图4：铁蛋白的过氧化物酶活性。（A） 以TMB、DPD和OPD为底物，在50℃时，铁蛋白样品的TEM图像及其过氧化物酶活性分析。（B）以p-HPPA（左)和鲁米诺(右）为底物，分析铁蛋白类过氧化物酶活性。（C）铁蛋白和HRP对过氧化物酶活性的热稳定性（左）和耐pH（右）比较。经允许转载^[41]。版权所有为2011美国化学学会

图5：马脾铁蛋白氧化铁核催化水氧化反应。经允许转载^[42]。版权所有2019 Springer Nature

除铁酶类和过氧化物酶类活性外，铁蛋白还具有其他类型的催化活性。据报道，马脾铁蛋白是一种在碱性环境下催化水氧化释放分子氧的铁基催化剂(pH11.0)^[42]（图5）。作者声明马脾铁蛋白的氧化铁核对这种催化活性有反应。当马脾铁蛋白纳米盒内铁被细菌消耗时，其水氧化活性降低。

马脾铁蛋白还被报道为催化马脾铁蛋白表面金纳米粒子合成的光催化剂。作者认为马脾铁蛋白的外表面具有与Au³ 离子结合的成核中心^[43]。马脾铁蛋白铁氧体矿芯具有半导体容量^[43]。铁氧体核的光化学激发将电子穿过马脾铁蛋白壳层，使AuCl^4-光还原，在假定的表面核中形成金纳米粒子于马脾铁蛋白的N位点^[43]。

1. 铁蛋白作为人造纳米酶
   1. 铁蛋白作为合成无机金属纳米材料的模板

由于独特的固定纳米腔结构和蛋白质壳层上的八个带负电荷的亲水通道，Fe² 和其他带正电荷的金属离子可以进入铁的空腔通过亲水通道自由传递。然后，这些金属离子可以催化在空腔的铁氧酶位点形成金属氧化物核。利用铁蛋白的这些特性，以铁蛋白为模板，以可控的方式合成无机金属纳米材料是一种有效的方法（表1）。

据报道，以铁蛋白为纳米反应器，在铁蛋白的8nm腔中合成了一系列无机金属氧化物纳米粒子（表1），包括Fe₃O₄ ^{[12, 44, 45]}, MnOOH^[46,47], In₂O₃ ^[48], TiO₂ ^[49], EuOOH ^[49], Co₃O₄ ^{[16, 50]} ,Ni(OH)₃ ^[51], Cr(OH)₃ ^[51], FeS ^[52], CdS ^[53], PbS^[54], ZnSe ^[55], FePO₄ ^[56] 纳米粒。附加氧化剂，例如H₂O₂加速金属离子的氧化，附加的NaOH促进矿化和成核。

此外，一些金属离子可以通过与亲水通道的静电相互作用与铁蛋白纳米粒子的内表面结合。在某些还原剂如抗坏血酸的存在下，这些金属离子被还原成金属原子，然后聚集在铁蛋白的腔内的金属纳米粒子中。通过这种方法，可在铁蛋白纳米材料中合成一些金属或金属合金纳米粒子（表1），例如Au ^[57], Ag ^[58], Cu ^[58],Pd ^[59], Co ^{[58, 60]}, Ni ^{[58, 60]}, Pt ^[61], CoPt ^[62],AuPd ^[63]。

当金属离子与铁蛋白的空腔结合时，纳米颗粒和磷酸盐被添加到溶液中，金属磷酸盐纳米粒子可以通过磷酸化过程在铁蛋白纳米粒子的腔内合成。通过这种方法，在HSA F纳米粒子腔内合成了可控尺寸的磷酸银纳米粒子^[64]。

与其他合成纳米粒子的方法相比，以铁蛋白为纳米反应器在其腔内合成纳米粒子有几个优点^[48,52]。⑴大小一致。由于有限的内腔尺寸和蛋白质外壳的精确催化作用，铁蛋白内纳米材料的生物矿化是可控的和有效的。所合成的纳米粒子的尺寸被限制在8nm以下，并且是均匀的。⑵单分散和良好的生物相容性。用铁蛋白壳对合成的纳米粒子进行纳米化，因此，铁蛋白的单分散状态、良好的生物相容性和铁蛋白外壳较低的生物毒性未受影响。⑶纳米粒子是在室温和温和环境下在铁蛋白纳米粒子中合成的，这与通常需要高温，高压和极酸性或碱性环境的正常化学合成不同。⑷便于表面功能修饰。通过遗传或化学方法，功能基序，如靶向分子、治疗药物，可以很容易地修饰到铁蛋白纳米颗粒上。因此，我们可以通过对铁蛋白蛋白壳的表面功能修饰，赋予在铁蛋白纳米粒子中合成的纳米粒子特定的功能。

• 1. 铁蛋白作为纳米反应器合成纳米酶

由于铁蛋白纳米作为纳米反应器合成尺寸可控的纳米材料的优越性，一些研究采用铁蛋白在其蛋白腔中合成纳米酶的方法各不相同方法（表20）（图6）。

铁蛋白腔内的金属离子氧化（图6A）或还原（图6B）是合成铁蛋白纳米酶的最常用方法。 通过两步还原反应，还合成了一些合金金属基铁蛋白纳米酶（图6C）。此外，通过在铁蛋白腔内直接氧化铁水铁心表面的金属离子，合成了铁蛋白纳米酶（图6D）。此外，通过铁蛋白的pH依赖的拆卸-再组装过程，一些纳米酶被纳入铁蛋白的腔内（图6E）。此外，一些金属离子结合在铁蛋白笼外表面。在添加还原剂后，在铁蛋白的外表面合成金属纳米酶（图6F）。综合起来，这些不同方法合成的铁蛋白纳米酶表现出不同种类的酶样活性，并在应用中发挥不同的作用。

表格1. 铁蛋白合成的无机金属基纳米材料总结

表2. 铁蛋白总结

• • 1. 具有类似铁酶活性的铁蛋白纳米酶

由于铁蛋白L亚基缺乏铁酶位点，重组L亚基铁蛋白(LFN)不具有铁的储存能力。在2014年，L.Li等人报告说，重组人LFN可以通过还原过程在其腔内合成Pt纳米粒子，从而获得类似铁酶的活性^[65]（图6B）。合成的LFn-Pt铁蛋白纳米酶可以催化Fe² 离子的氧化，获得铁的储存能力，从而调节细胞环境中铁的稳态^[65]。

此外，铁蛋白纳米酶可用于增强铁蛋白的铁酶样活性。通过还原过程，在HSAF腔中合成了Au、Ag、Pt纳米粒子。获得的HSAF-Au ^[66], HSAF-Ag ^[66], HSAF-Pt ^[67]铁蛋白纳米酶展示了与HASF相比更高的酶活性。一系列实验表明，这些纳米酶提高了铁蛋白在体内的铁摄取能力^[66,67]。

• • 1. 具有过氧化物酶样活性的铁蛋白纳米酶

一些类型的铁蛋白纳米酶被报道显示过氧化物酶样活性。在发现Fe₃O₄纳米粒子类过氧化物酶活性后^[1]，我们的小组认识到，铁蛋白纳米粒子腔内的仿生矿化Fe₃O₄核也可能表现出过氧化物酶活性。随后，我们在重组人H亚基铁蛋白(HFN)腔中合成了Fe₃O₄核(4.7plusmn;0.8nm)^[12]。利用其过氧化物酶样活性，对HFn-Fe₃O₄纳米酶进行肿瘤诊断试验^[12]。

从那时起，许多金属氧化物纳米粒子，例如Fe₃O₄ ^{[17, 68, 69]}, Co_XFe_3-XO₄ ^[69], Co₃O₄ ^[16]被报道它们能仿生矿化并沉积在铁蛋白纳米粒子的腔内，并表现出过氧化物酶样活性。通过同时负载Fe² 和Co² 离子，在HFn腔内形成了一系列Co_XFe_3-XO₄矿质岩芯^[69]。这些Co_XFe_3-XO₄矿芯的尺寸控制在6nm左右，分布较窄^[69]。并且合成的HFn-Co_XFe_3-XO₄铁蛋白纳米酶比HFn-Fe₃O₄纳米酶具有更高的过氧化物酶活性^[69]。

另外，我们的工作之一显示通过模拟铁蛋白的铁负载过程，毛球菌铁腔内形成Co₃O₄核^[16]（图6A）。我们通过计算K_cat/K_M，比较了pfFn-Co₃O₄和pfFn-Fe₃O₄铁蛋白纳米酶的催化活性，它反映了酶对特定底物的催化效率。制备的pfFn-Co₃O铁蛋白纳米酶比pfFn-Fe₃O₄铁蛋白纳米酶具有更高的过氧化物酶活性，因为pfFn-Co₃O₄铁纳米酶的K_cat/K_M分别比用于底物TMB和H₂O₂的pfFn-Fe₃O₄铁纳米酶高20倍^[16]。

Lucia Melnikova等人报告说，在HSAF腔中生物合成了Fe₃O₄/gamma;-Fe₂O₃纳米酶^[68]。 HSAF-Fe₃O₄/gamma;-Fe₂O₃具有过氧化物酶样活性，在N,N-二乙基-对苯二胺硫酸盐(DPD)底物存在下催化H₂O₂的分解^[68]。通过增加Fe² 离子的负载量，HSAF内形成的Fe₃O₄/gamma;-Fe₂O₃磁芯的尺寸从3.21nm增加至6.83nm。研究表明，HSAF-Fe₃O₄/gamma;-Fe₂O₃过氧化物酶活性与Fe₃O₄/gamma;-Fe₂O₃磁芯尺寸呈线性关系^[68]。磷铁蛋白很少表现出类似过氧化物酶活性^[68]，这与Tang等人的报告是一致的^[41]。

据报道，[Fe(CN)₆]^4-离子在马脾铁蛋白氧化铁核表面与Fe³ 离子反应，可在铁水化合物表面形成普鲁士蓝纳米粒子(PBNPs)当铁蛋白腔内处于酸性环境下(pH3.0)^[70]（图6D）。马脾铁蛋白-PBNPs铁蛋白纳米酶表现出与普鲁士蓝包覆Fe₂O₃磁性纳米粒子类似的过氧化物酶活性， 它可催化过氧化物酶底物TMB和2,2rsquo;-偶氮-双（3-乙基苯并-噻唑啉-6-磺酸）(ABTS)进行颜色反应^[70]。马脾铁蛋白-PBNPs纳米酶的过氧化物酶样活性为pH，温度依赖性强，与典型的Michaelis-Menten 动力学H₂O₂、TMB和ABTS底物反应动力学吻合较好^[70]。马脾铁蛋白-PBNPs铁蛋白纳米酶在ABTS为底物时对H₂O₂具有较高的亲和力和敏感性，使马脾铁蛋白-PBNPs铁蛋白纳米酶成为一种敏感的酶用于葡萄糖检测^[70]。

图6：铁蛋白纳米酶的合成策略。(A)铁蛋白纳米酶的氧化生物反应。(B)还原合成铁蛋白纳米酶。(C)铁蛋白纳米酶的两步还原合成。(D)氧化和沉积法合成铁蛋白纳米酶。(E)基于铁蛋白纳米酶的pH依赖的反组装合成。(F)铁蛋白纳米酶的外表面还原合成。(PDB entry 5N27)。

通过将金属离子加载到铁蛋白的腔内，然后进行还原过程，一些金属纳米粒子，如金团簇^[71]，铁原子^[72]和Fe-Pt、Fe-Pd、Fe-Rh合金纳米粒子（两步还原）^[72]（图6C），它们是在HSAF腔内合成的，并表现出类似过氧化物酶的活性。HSAF-金铁蛋白纳米酶具有2 nm的金簇，在酸性条件下和高温下，其过氧化物酶活性高于天然酶（超过60°C）^[71]。

张炜等人报道，当Fe² 离子结合到HSAF的内腔时，加入还原剂后，HSAF腔中的16个Fe原子被还原^[72]。这种HSAF-Fe铁蛋白纳米酶具有过氧化物酶样活性，可用于H₂O₂的检测^[72]。通过继续负载其他金属离子，如Pt、Rh和Pd，在HSAF腔内形成矿物核(Fe-Pt、Fe-Rh、Fe-Pd)，粒径分布较窄(约6nm)^[72]（图6C）。合成的HSAF-Fe-Pt、HSAF-Fe-Rh和HSAF-Fe-Pd铁蛋白纳米酶的过氧化物酶活性比HSAF-Fe铁蛋白纳米酶高得多^[72]。

一些贵金属离子也锚定在铁蛋白纳米粒子的外表面，从而形成的非涂层金属纳米粒子具有酶活性。例如，Marie Peskova等人报告说，Ag和Pd离子结合在毛球虫铁蛋白外表面(pfFn)^[73]。通过控制反应体系中金属离子和还原剂的含量，非包覆Ag和Pd纳米粒子在pfFn的外表面合成，尺寸分布受限（Ag为4.7 plusmn;1.59nm，Pd为4.21plusmn;1.39nm）^[73]（图6F）。合成的pfFn-Ag和pfFn-Pd铁蛋白纳米酶具有过氧化物酶样活性，其酶活性受洗涤剂的影响^[73]。pfFn-Ag铁蛋白纳米酶的过氧化物酶活性仅在十二烷基硫酸钠(SDS)存在时才能检测到，而pfFn-Pd铁蛋白纳米酶的过氧化物酶活性在SDS等阴离子洗涤剂的作用下增强^[73]。

• • 1. 具有氧化酶活性的铁蛋白纳米酶

S. kanbako - aksu等报道了在pfFn腔内通过还原过程合成了尺寸分布为5plusmn;1 nm的Pt纳米团簇^[74]（图6B）。合成的pfFn-Pt铁蛋白纳米酶具有氧化酶样的活性，过氧化氢酶在O₂存在下对醇类进行有氧氧化^[74]。pfFn具有良好的热稳定性和高亲水性，使其成为高温或其他恶劣环境下醇类需氧氧化的可靠催化剂。

• • 1. 具有超氧化物歧化酶样活性的铁蛋白纳米酶

利用铁蛋白、纳米酶(如纳米CeO₂)的pH依赖的反组装特性^[75]，可以封装在铁蛋白纳米笼的腔内。在酸性条件下，pH为2.0时，铁蛋白纳米被分解成亚基，一旦pH恢复到生理状态，铁蛋白亚基被重新组装成蛋白纳米酶。因此，在重组过程中，CeO2纳米颗粒可以被封装到HSAF纳米晶的空腔中^[75]（图6E）。在相同浓度的Ce原子下，HSAF-CeO₂铁蛋白纳米酶具有比CeO₂纳米酶更高的SOD样活性，清除活性氧(ROS)。

• • 1. 具有多酶活性的铁蛋白纳米酶

某些种类的铁蛋白纳米酶表现出多酶样活性。例如，贾凡等人报告说，在HSAF腔内通过还原合成了1.87plusmn;0.40nm的Pt纳米粒子^[76]（图6B）。HSAF-Pt铁蛋白纳米酶以pH和温度依赖性的方式表现出过氧化物酶和过氧化氢酶活性^[76]。在酸性pH条件下，HSAF-Pt铁蛋白纳米酶主要表现为过氧化物样活性，最佳pH为4.0，与天然HRP相同。在中性和碱性条件下，HSAF-Pt铁蛋白纳米酶主要表现为过氧化氢样活性，而过氧化氢样活性随着pH值的增加而增强（从pH7.0到pH12.0）^[76]。过氧化物酶和过氧化氢酶活性在高温下，铁蛋白纳米酶的活性在60℃以上仍能保持^[76]。此外，当温度从20℃升高到80℃时，HSAF-Pt铁蛋白纳米酶的过氧化氢酶活性逐渐增加，而HSAF-Pt铁蛋白纳米酶的过氧化物酶活性则逐渐降低^[76]。 此外，作者还发现，HSAF本身是一种没有铁的蛋白质外壳，不具有过氧化物酶样活性^[76]，表明过氧化物酶样活性来源于内Pt纳米粒子，而不是铁蛋白壳层。这一结论与Tang等人2011年的报告一致^[41]。

此外，张连兵等人还发现，HSAF-Pt铁蛋白纳米酶在pH7.4生理环境下表现出过氧化氢酶和SOD活性^[77]。HSAF-Pt铁蛋白纳米酶的过氧化氢酶和SOD活性共同作用，消除细胞间ROS。随后，他们在HSAF内还原合成了一个3nm的PtAu合金纳米颗粒，发现HSAF-PtAu铁蛋白纳米酶具有比HSAF - Pt铁蛋白纳米酶更高的过氧化氢酶和类SOD活性^[77]。

金-银合金纳米粒子也被报道在HSAF腔内通过还原合成^[79,80]。改变反应体系中金原子/银原子的比例并不影响金-银合金纳米颗粒(约6纳米)在HSAF内的均匀尺寸^[80]。合成的HSA F-AuAg铁蛋白纳米酶对4-硝基苯酚的还原具有催化活性^[80]。不久之后，有报道称HSAF-AuAg铁蛋白纳米酶同时表现出过氧化物酶、过氧化氢酶和SOD样活性，用于细胞保护^[79]。结果表明，这三种酶样活性主要来自于金-银合金纳米颗粒，而HSAF蛋白壳则加速了电子传递，促进了催化过程^[79]。

范克龙等报道氮掺杂多孔碳纳米球（N-PCNSs）具有四种酶样活性（氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶）^[81]。在N-PCNSs纳米酶外表面（100plusmn;10nm）化学偶联重组人HFn纳米酶，合成了铁蛋白纳米酶（Hfn-N-PCNSs）^[81]。

• • 1. 具有其它类似酶活性的铁蛋白纳米酶

一些人工金属酶也被报道被包裹或在铁蛋白纳米笼的腔内合成。例如，人工金属酶[Cp*Ir(biot-p-L)Cl]·Sav(尺寸分布为4.5 nm·5.5 nm·5.1 nm)在HSAF腔内采用pH相关的拆卸-再组装方法封装^[82]。

另一项研究表明，人工金属酶[Rh(nbd)Cl]₂可以在重组马LFn的内腔中定点固定化^[83]。这种铁蛋白纳米酶对苯乙炔的聚合具有催化活性^[83]。

这些工作表明，铁蛋白纳米酶可能是保护人工金属酶免受恶劣环境和体内输送人工金属酶的理想策略。

1. 铁蛋白纳米酶的应用
   1. 生物传感
      1. H₂O₂检测

利用HSAF-Fe₃O₄/gamma;-Fe₂O₃铁蛋白纳米酶发挥其酶样活性，进行H₂O₂检测^[68]。在H₂O₂存在下，HSAF-Fe₃O₄/gamma;-Fe₂O₃催化底物DPD氧化为自由基阳离子DPD 。在551nm处，DPD 产生稳定的紫色，而在反应体系中加入H₂O₂的量决定了这种吸收。通过绘制每分钟吸收值增加量(dA/min)与H2O2浓度之间的标准曲线，可以确定在5.8-88.2 mM范围内H₂O₂的浓度^[68]。由于氧化物TMB在652nm处产生峰值吸收的蓝色，HSAF-Fe铁蛋白纳米酶被报道使用TMB作为底物检测H₂O₂^[72]。

• • 1. 葡萄糖检测

在葡萄糖氧化酶(GOx)存在下，氧催化氧化葡萄糖产生H₂O₂。测定该反应产生的H₂O₂浓度间接反映了葡萄糖的浓度。具有过氧化物酶活性的铁蛋白纳米酶，例如HSAF-PBNPs ^[70]、HSAF-Au ^[71]和HSAF-Fe ^[72]，就以这种方式用于葡萄糖检测。由于HSAF-PBNPs对H₂O₂的亲和力较高，葡萄糖可低至0.39micro;M，线性范围为0.39micro;M至6.25micro;M^[70]。基于HSAF-PBNPs的葡萄糖检测系统比裸GO-COOH(1micro;M)和Fe₃O₄(5micro;M)纳米酶更敏感^[70]，表明铁蛋白纳米酶在生物传感中优于裸纳米酶。

• • 1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）

HSAF-PB NPs铁蛋白纳米酶也被用来进行ELISA检测抗马脾铁蛋白抗体^[70]。阳性结果还表明，纳米酶的负载不影响铁蛋白壳的靶向能力。

• 1. 疾病诊断
     1. 肿瘤诊断

在2012年，Kelong Fan等人首次报道了HFn-Fe₃O₄铁蛋白纳米酶是靶向和可视化肿瘤组织的双功能药物^[12]（图7）。以人HFn为腔体，仿生合成了Fe₃O₄纳米粒子。HFn特异性地与过表达转铁蛋白受体1 (transferrin receptor 1, TfR1)的肿瘤细胞结合^{[9,12 -15]}，而Fe₃O₄核在H₂O₂存在下发挥过氧化物样活性，催化底物二偶氮氨基苯(DAB)氧化，产生显色反应。铁蛋白赋予纳米酶靶向肿瘤的能力。HFn-Fe3O4铁蛋白纳米酶的双重功能使其成为肿瘤组织快速病理诊断的一步试剂。HFn-Fe₃O₄铁蛋白纳米酶与传统的HRP标记的肿瘤诊断抗体相比具有节省时间、成本低、操作简便等优点。作者检查了来自9种类型肿瘤患者的474个临床标本，他们证实铁蛋白纳米酶可以区分肿瘤细胞与正常细胞，敏感性为98%，特异性为95%。

图7：(A) HFn-Fe3O4铁蛋白纳米酶的合成工艺。(B) HFn-Fe3O4铁蛋白纳米酶的低温TEM图像。标度棒= 20 nm (C) HFn-Fe3O4铁蛋白纳米酶靶向并观察移植的人肿瘤组织。人结直肠癌细胞系HT-29，人卵巢癌细胞系SKOV-3，肝癌细胞系SMMC-7721为tfr1阳性细胞，人乳腺癌细胞系MX-1为tfr1阴性细胞。在FITC结合的HFn组中，绿色信号代表FITC，蓝色信号代表dpi染色的细胞核。在M-HFn和抗tfr1抗体组中，先用DAB(黄褐色信号)染色，再用苏木精(淡蓝色信号)染色。经许可转载^[12]。2012 Springer Nature版权所有。

图8：基于HccFn-Co₃O₄铁蛋白纳米酶的HCC诊断。(A)基于HccFn-Co₃O₄铁蛋白纳米酶的HCC诊断示意图。(B) HccFn-Co₃O₄铁蛋白纳米酶Co3O4核心和蛋白笼的透射电镜(TEM)图像。响应纳米颗粒的大小分布如图右上角所示。标尺= 50nm。(C)肝细胞癌组织芯片中HccFn-Co₃O₄铁蛋白纳米酶染色。正常肝组织和HCC组织经DAB(黄褐色信号)染色，苏木精(淡蓝色信号)复染。(D) HccFn-Co₃O₄铁蛋白纳米酶对非肿瘤肝组织和HCC组织的染色分析。经许可转载^[16]。2019 American Chemical Society版权所有。

在2017年，张同伟等人报道，通过将HFn-Fe₃O₄代换成钴掺杂的HFn-Co_XFe_3-XO₄铁蛋白纳米酶，其过氧化物酶活性增强^[69]。作者在HFn蛋白壳内合成了一系列不同钴掺杂比(0、20%、40%、60%)的Co_XFe_3-XO₄核。他们发现HFn-Co_X Fe_3-XO₄铁蛋白纳米酶的过氧化物酶活性与Co_X Fe_3-XO₄核的钴掺杂比呈正相关。铁蛋白纳米酶的过氧化物类活性依赖于其矿物核。HFn-Co_XFe_3-XO₄铁蛋白纳米酶类过氧化物酶活性的增强使其成为一种更灵敏的肿瘤诊断试剂。

在2019年，江冰等人报告说，在肝细胞癌(HCC)靶向肽(SP94)的腔内仿生合成了Co₃O₄核，显示为pfFn(HccFn)纳米粒子^[16]。合成的铁蛋白纳米酶命名为HccFn-Co₃O₄。HccFn铁蛋白纳米具有靶向HCC的能力，这是通过基因工程方法将HCC细胞特异性肽SP94显示在pfFn的外表面而实现的。Co₃O₄核的过氧化物样活性催化底物发生显色反应，使HCC肿瘤组织可视化。由于Co₃O₄核心的过氧化物类活性明显高于Fe₃O₄核心(催化效率高出20倍)，且HccFn具有HCC靶向能力，因此HccFn-Co₃O₄铁蛋白纳米酶对HCC的特异性诊断具有较高的敏感性(图8)。作者检测了424例临床HCC标本，证实HccFn-Co3O4铁蛋白纳米酶可将HCC组织与正常肝组织区分开来，其敏感性为63.5%，特异性为79.1%，与临床上使用的HCC特异性标志物甲胎蛋白(AFP)相当。此外，病理分析表明，HccFn-Co3O4铁蛋白纳米酶染色结果是预测HCC患者预后的一个潜在指标。染色强度与HCC患者的肿瘤分化程度(P = 0.0246)、肿瘤浸润程度(P lt; 0.0001)呈正相关，与总生存期(P = 0.0084)呈负相关。

• • 1. 心血管疾病诊断

进一步探索HFn-Fe₃O₄铁蛋白纳米酶，其可用于人类高危和破裂动脉粥样硬化斑块的病理鉴定^[17]。作者表明，HFn通过与TfR1的相互作用，可以内在地识别斑块浸润的活性巨噬细胞。斑块浸润的活性巨噬细胞驱动动脉粥样硬化斑块的进展和破裂，并与斑块易损性显著相关，因此HFn-Fe₃O₄铁蛋白纳米酶可特异性染色不稳定的破裂斑块(图9)。稳定斑块很少存在斑块浸润的活性巨噬细胞，因此HFn-Fe₃O₄铁蛋白纳米酶没有染色稳定斑块。

• 1. 癌症治疗

铁蛋白作为一种纳米载体被广泛应用于各种癌症治疗药物的递送。由于其独特的自组装能力，中空腔能够封装药物，且外表面可以实现铁蛋白经过基因和化学上的靶向修饰，最近成为一种很有前途的药物递送载体^[84]。许多化疗药物和小分子，如阿奇霉素^[85]、顺铂^[86]、姜黄素^[87]、吉非替尼^[88]、siRNA^[89]等，都被封装到铁蛋白中用于癌症治疗。然而，利用铁蛋白纳米酶的酶样活性来杀灭肿瘤细胞的研究报道较少。如下所述，我们介绍了一种铁蛋白纳米酶，它结合了铁蛋白的肿瘤靶向性和纳米酶的多酶样活性来治疗肿瘤。

2018年，范克龙等报道称，HFn-N-PCNSs铁蛋白纳米酶(HFn-N-PCNSs ferritin nanozymes)具有四种类似酶的活性(氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和SOD)，它们负责ROS的调节^[81]。由于HFn的肿瘤靶向性和溶酶体定位能力以及N-PCNSs纳米酶在酸性条件下胞内ROS生成能力，HFn-N-PCNS铁蛋白纳米酶被用于肿瘤靶向催化治疗^[81]。在肿瘤细胞表面过度表达的TfR1与HFn特异性结合，然后HFn被内吞到溶酶体中，其中pH环境是酸性的。一旦HFn-N-PCNSs铁蛋白纳米酶定位于肿瘤溶酶体的酸性pH环境，它主要表现为过氧化物酶和氧化酶活性。这两种类似酶的活性使它能够发挥活性氧的动员作用，包括⑴伴随着O₂的消耗将氧转移到自由基，和⑵将H₂O₂催化成自由基，从而协同破坏ROS水平，引起细胞损伤。肿瘤细胞中产生的过量ROS导致肿瘤消退(图10)。

图9：HFn-Fe3O4铁蛋白纳米酶特异性染色不稳定和破裂的斑块^[17]。颈动脉有不稳定的破裂斑块(A)和稳定斑块(B)分别用Masson(用于胶原分布鉴定)、HE和HFn-Fe₃O₄铁蛋白纳米酶(DAB染色，苏木精复染)获得。箭头表示组织学切片位置。经许可转载^[17]。版权所有清华大学出版社和德国斯普林格-维拉格有限公司，Springer Nature的一部分。

• 1. 抗氧化和保护细胞

铁蛋白纳米酶通过其类似酶的活性来消除活性氧，从而在体内起到抗氧化和保护细胞的作用。2010年，张连冰等报道HSAF- Pt铁蛋白纳米酶在pH 7.4生理环境下表现出过氧化氢酶和类SOD活性^[77]。当与5mm H₂O₂胁迫的Caco-2细胞孵育时，HSAF-Pt铁蛋白纳米酶保护细胞不受ROS损伤，并显著提高细胞活力(图11 A)。有趣的是，HSAF也表现出细胞保护能力，这表明载铁蛋白也可能具有消除ROS的能力。后来，他们发现HSAF-PtAu铁蛋白纳米酶 与HSAF-Pt相比，具有更高的过氧化氢酶和SOD样活性，对细胞保护效果较好^[78]。作者还认为HSAF在细胞表面具有受体。通过受体介导的内吞作用，铁蛋白纳米酶可能进入细胞并发挥酶样活性以消除细胞内ROS(图11B)。这一假设后来得到证实，因为作者发现HSAF-Pt和HSAF-PtAu铁蛋白纳米酶显著降低了2mM H₂O₂胁迫的CaCO-2细胞的细胞内ROS。胞吞抑制剂氯丙嗪处理后，Caco-2细胞内ROS明显升高(图11 C)。

图10：铁蛋白纳米酶治疗癌症。(A) HFn-N-PCNSs铁蛋白纳米酶诱导肿瘤细胞死亡的原理图。(B)HFn-N-PCNSs铁蛋白纳米酶具有四种酶样活性。(C) HFn-N-PCNSs铁蛋白纳米酶治疗肿瘤的反应。(D) HFn-N-PCNSs铁蛋白纳米酶在肿瘤组织中的积累。白色箭头表示HFn-N-PCNSs铁蛋白纳米酶的位置。经许可转载^[81]。版权所有Springer Nature。

此外，HSAF-Au-Ag铁蛋白纳米酶具有三重酶活

资料编号：[368946]