CRIM制备工艺的研究文献综述

 2022-12-29 14:43:18
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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

1.研究背景

近年来，嵌合抗原受体 T( CAＲ-T) 细胞免疫疗法是当下肿瘤免疫治疗的热点之一。全球的 CAR-T 研究从 2008、2009 年开始正式起步，自2012年起，CAR-T 细胞免疫疗法先后在急性淋巴细胞白血病( ALL) 、慢性淋巴细胞白血病( CLL) 、B 细胞淋巴瘤包括滤泡性淋巴瘤( FL) 和弥漫性大 B 细胞淋巴瘤( DLBCL)的治疗中取得前所未有的成功，给血液系统肿瘤治疗带来了新的希望，目前，全球有数百个研究中心正在针对CAR-T疗法进行基础研究和临床研究。在众多如CD19、CD22、CD30等靶点中，以B细胞表面标志物CD19为靶点构建的CAR-T细胞是迄今为止构建最广泛的CAR-T细胞，其临床治疗效果也令人振奋，即使针对难治、复发的肿瘤也能取得60%～80%的缓解率。尽管 CAＲ-T细胞移植疗法能使众多复发难治性肿瘤患者再次获得缓解，但仍有30%～50%的肿瘤患者在接受CAＲ-T 细胞移植疗法治疗后 1 年内出现疾病进展或复发，有10%～20%的患者在接受 CAＲ-T 细胞移植疗法治疗后未得到缓解。这些研究结果提示，应用 CAR-T 细胞移植疗法治疗肿瘤仍然存在诸多挑战。

2.课题目的

CAR-T制剂制备工艺包含质粒制备，病毒载体制备，细胞采集和分离，细胞转导及扩增和安全性检测。本课题将选取制剂制备工艺中细胞转导扩增为研究方向，研究各个因素对转导扩增的影响。

3.主要研究内容

1.慢病毒转导条件优化：从病毒滴度，MOI值，促转导试剂，转导方式等方面进行实验设计，根据实验结果优化参数。

2.细胞扩增优化：从细胞的起始数量，培养时间，培养基，细胞因子的种类和细胞因子的加入量进行实验设计，再根据实验结果优化参数。

4.课题工作进度

2020.3-2020.4：前期文献调研。

2020.4-2020.5：CRIM转导及扩增工艺的研究和优化。

2020.5-2020.6：整理实验记录，撰写毕业设计，准备毕业答辩。

5.参考文献[1] 杜璇.CAR-T疗法的研发现状与展望[J].中国医药工业杂志,2019,50（12）：1524-1529[2] 赵琳,赵汉新.CAR-T细胞技术的研发及临床应用前景[J].中国合理用药探索，2020,2（17）:1-7[3] 周祺祺,孙倩,王先火等.嵌合抗原受体 T 细胞制备及临床应用的影响因素研究进展[J].山东医药,2019,59（36）：104-107[4] D，ALOIA MM， ZIZZARI IG，SACCHETTI B，et al. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors[J]. Cell Death Dis，2018，9（3）：282等等。

6.文献综述

CAR-T细胞的原理及制备工艺研究

高雪莲 中国药科大学

摘要： 近年来，嵌合抗原修饰的T细胞（CAR-T）免疫疗法在肿瘤治疗中表现出良好的治疗效果，已成为继手术治疗、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。深入了解CAR-T细胞的完整结构和功能，理解其作用原理，有助于制备出具有更强靶向性和杀伤性的CAR-T细胞。

关键词： 嵌合抗原修饰的T细胞免疫疗法；完整结构和功能；制备工艺

Study on the principle and preparation of CAR-T cells

Gao xuelian, China pharmaceutical university

Abstract： in recent years, chimeric antigen modified T cell (car-t) immunotherapy has shown a good therapeutic effect in tumor treatment, and has become the fourth tumor treatment method after surgery, radiotherapy and chemotherapy. In-depth understanding of the complete structure and function of CAR T cells and the mechanism of their action is conducive to the preparation of CAR T cells with stronger targeting and destruction.

key words： chimeric antigen modified T cell immunotherapy; Complete structure and function; The process of preparation

1. CAR-T的原理概述

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法是指通过基因修饰技术，使T细胞表面嵌合上嵌合型抗原受体（CAR），当CAR在T细胞表面表达时，T细胞就能直接与肿瘤细胞表面的抗原特异性结合，同时T细胞被激活，然后通过释放穿孔素、颗粒酶素 B 等直接杀伤肿瘤细胞[[1]]。

与传统的Ｔ细胞免疫治疗相比，CAR-T细胞技术的独特之处在于：（1）ScFv片段的表达使得CAR-T细胞具有靶向性，特异性作用于肿瘤细胞。（2）识别肿瘤抗原无需主要组织相容性复合体（MHC）限制，能够识别 MHC 非依赖型靶标[[2]]，这一特点使得CAR-T细胞免疫疗法具有了多靶点性，而且对表达相同抗原的肿瘤均具有识别杀伤能力[[3]]。（3）CAR-T可以通过共刺激分子信号增强Ｔ细胞免疫的杀伤性，从而克服由于肿瘤细胞下调ＭＨＣ表达或抑制共刺激分子分泌而造成的免疫逃逸[[4]]。改造后的CAR-T细胞在抗瘤治疗中具有更强的靶向性和杀伤性。

2.CAR-T的结构与功能

嵌合型抗原受体 CAR（ chimeric antigen receptor ，CAR）可分为 4 个部分，即识别肿瘤相关抗原（TAA）的抗体单链可变区（ScFv片段）、铰链区、跨膜区、共刺激区和T细胞活化区[[5]]，其中CAR 的ScFv片段可通过跨膜区与T细胞活化区偶联。胞外区通过肿瘤单链抗体可变区来实现靶向功能，胞内区通过T细胞信号活化区负责T细胞的活化以及增强细胞毒效应功能。

CAR-T细胞技术主要历经了四代研发过程，这四代CAR-T细胞技术的区别主要体现在：通过基因编辑技术在受体上加入了不同种类的共同刺激因子，不同程度地增强了T细胞的杀伤活性和增殖活性，同时也延长了T细胞的体外存活时间。第五代通用型嵌合抗原受体仍在研发过程中，结果值得期待。

3.CAR-T的制备

嵌合抗原受体T细胞的制备过程相对复杂，选取的作用靶点不同对应的制备过程也不尽相同，但是大致的制备流程是一样的：抽取患者血液，激活并提取T细胞，并通过基因工程改造，使T细胞表达特异性抗原结合位点来识别肿瘤抗原，再将改造成功的CAR-T细胞体外扩增培养至一定规模后回输入患者体内进行治疗。目前最成功的是针对CD19的治疗急性淋巴性白血病的 CAR-T，在临床试验上已取得了令人瞩目的成绩。下文将针对制备过程的几大步骤以及相关影响因素来进行介绍。

3.1提取T细胞

CAR-T细胞需要提取患者自体的外周血，然后利用血细胞去除法和免疫磁珠法获得抗原特异性T淋巴细胞。由于多数患者曾接受具有细胞毒性反应的治疗，常常导致患者达不到CAＲ-T 细胞移植疗法治疗前所要求的T细胞数，而不得不放弃该治疗[[6]]。还有一些患者由于化疗或者服用其他免疫治疗药物的影响导致患者T细胞的质量较差，无法满足治疗要求而弃疗。如果使用他人提供的T细胞，又存在免疫排斥的问题，所以拥有足够数量且质量达标的T细胞成为CAR-T细胞技术能否应用的关键因素。为了解决这一问题，有研究者们尝试采用异体干细胞[[7]]来制备CAR-T细胞，正在进行临床前研究[[8]]，而且有结果[7]显示，采用异体干细胞来制备CAR-T细胞的患者患移植物抗宿主病（GVHD）的概率很低，有望突破GVHD瓶颈，最终为 CAR-T 细胞技术的规模化应用奠定基础。。

3.2基因工程改造

目前CAR-T细胞技术中改造患者T细胞时应用最多的仍是以病毒作为载体中介[[9]]，其中最为常见的仍是逆转录病毒和慢病毒[3]。两者的基因转导效率都很高，而其中慢病毒的感染效率更高，表达更持久且能传递大片段DNA序列[[10]]。现以CD30靶点为例，进行基因编辑。首先通过PCR技术设计并合成得到靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30的编码基因序列，然后将CAR-CD30的编码基因插入到质粒载体（比如慢病毒核心质粒pWPXLD载体）的BamH I和EcoR I酶切位点中，得到重组质粒。重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。此处可采用人类细胞株293T作为包装细胞进行瞬时转染，利用磷酸钙转染法将上述的重组质粒制备成慢病毒悬液，超速离心法浓缩病毒液以备用。当然也可以应用DNA转座子和电穿孔等技术进行基因编辑，DNA转座子技术是在第四代CAR-T细胞技术中才应用起来的，但是进展很快，比如，基因工具“睡美人”（SB）转座子系统[[11]],[[12]]和Piggybac转座子系统[[13]]进展较快。

3.3 CAR-T细胞体外扩增

用浓缩病毒液感染抗原特异性T淋巴细胞后能成功获得的阳性CAR-T细胞数量较少，需要在体外进行扩增培养至一定的数量后，才能回输入患者体内进行治疗。目前有两种扩增方案用于制备 FDA 批准的 CAＲ-T 细胞产品[[14]],[[15]]。 一种是将 CD3 单克隆抗体加入培养液来刺激CAR-T细胞活化增殖；另一种是采用CD3 /CD28 抗体偶联磁珠直接对 CAＲ-T 细胞进行分离富集后，通过磁珠上的抗 CD3 和抗 CD28 抗体介导CAＲ-T 细胞活化增殖[6]。同时，研究者们还发现，在体外扩增时加入一些细胞因子能对该过程起到促进作用，且促进效果不尽相同。

4.总结及展望

相比其他三大肿瘤治疗手段而言，CAR-T细胞技术发展时间较短，在制备CAR-T细胞时，比如在分选、活化、改造、扩增、回输等各步操作中仍存在一些棘手的问题，导致最终的治疗效果不够理想，但不可否认它在肿瘤治疗中成果斐然，相信在未来随着各方面技术的进步，CAR-T细胞技术会越来越成熟，使更多患者受益。

学生签名： 高雪莲 2020年 3 月 17 日

指导教师意见：

指导教师签名： 年 月 日

所在教研室（实习单位）审查意见：

负责人签名： 年 月 日

填写说明

1.指导教师意见填写对文献综述的评语，对本课题的深度、广度及工作量的意见和对论文结果的预测；

2.所在教研室（实习单位）审查意见包括对指导教师意见的认定和是否同意开题等。

参考文献

  1. [] 杜璇.CAR-T疗法的研发现状与展望[J].中国医药工业杂志,2019,50（12）：1524-1529 uarr;

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  3. [] 赵琳,赵汉新.CAR-T细胞技术的研发及临床应用前景[J].中国合理用药探索，2020,2（17）:1-7 uarr;

  4. [] 李芳.CAR-T细胞免疫疗法的原理及最新研究进展[J].现代医药卫生,2019,35（23）：3648-3651 uarr;

  5. [] 陈玥,莫泽明,秦笛源等.靶向ROR1的嵌合抗原受体修饰Ｔ细胞的构建及对ROR1阳性肿瘤细胞的杀伤作用[J].四川大学学报（医学版）,2019,50（2）：145-151 uarr;

  6. [] 周祺祺,孙倩,王先火等.嵌合抗原受体 T 细胞制备及临床应用的影响因素研究进展[J].山东医药,2019,59（36）：104-107 uarr;

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