mydgf融合蛋白的构建文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、拟研究的问题

MYDGF是一种分泌型细胞生长因子，该蛋白用于治疗急性心肌梗死（AMI）作用已得到证明。然而MYDGF分子量只有15.7KD左右，LC-MS检测该蛋白在小鼠体内的半衰期只有15min，这为后续研究带来极大不便。因此，构建具有优秀活性的长效化MYDGF蛋白是我们需要解决的问题。有研究表明，MYDGF的C端延伸出的片段对其活性影响较小，因此可考虑从该方面入手。本课题将从以下方面完成：

1. 根据目前常用延长蛋白半衰期的方法，通过分子生物学技术，将IgG1抗体的Fcalpha;片段融合至MYDGF蛋白的C端，完成MYDGF-Fc融合蛋白的设计
2. 合成MYDGF-Fc目的基因
3. 完成MYDGF-Fc真核表达载体的构建
4. 以目前常用的四质粒病毒包装系统，完成感染宿主CHO细胞的MYDGF-Fc病毒的制备
5. 转染CHO细胞后，利用有限稀释法，挑选高表达MYDGF-Fc的工程细胞。
6. 研究手段
7. 文献研究法

实验前期，检索MYDGF蛋白相关文献，筛选总结有用信息。

1. 实验法

根据已有文献资料，进行实验前的方案设计，完成后通过实验证实相关猜想。

1. 定量及定性分析法

如通过Lowry法检测蛋白浓度，SDS-PAGE、HPLC法检测蛋白纯度，质谱法分析分子量等。

三、文献综述

MYDGF融合蛋白的构建

【摘要】MYDGF全称为骨髓源性生长因子，为骨髓来源的单核巨噬细胞产生的旁分泌蛋白。已有研究发现MYDGF具有增强血管内皮细胞增殖，促进血管生成，保护心肌细胞的作用，可用于治疗心肌梗死^[1]。大多数蛋白质类药物的半衰期较短，构建融合蛋白可延长蛋白体内半衰期,提高药物应用便利性。本文主要阐述MYDGF蛋白的特性及融合蛋白的构建方式。

【关键词】骨髓源性生长因子；融合蛋白

Construction of MYDGF fusion protein

【Abstract】MYDGF is a bone marrow-derived growth factor, a paracrine protein produced by bone marrow-derived monocyte macrophages. It has been found that MYDGF can enhance the proliferation of vascular endothelial cells, promote angiogenesis, and protect myocardial cells, and can be used to treat myocardial infarction.Most protein drugsrsquo; half-time is short,so construction of fusion protein can prolong protein half-life in vivo and improve convenience . This article mainly explains the characteristics of MYDGF protein and the way to construct fusion proteins.

【Keyword】Bone marrow-derived growth factor; fusion protein

急性心肌梗死（AMI）是由于冠状动脉病变导致心肌急性，持续性缺血缺氧，造成心肌坏死的病症,是世界范围内疾病死亡的主要原因之一。近年来，AMI在中国呈上升趋势，因此，如何治疗AMI是医学研究领域关注的焦点。目前来说，冠状动脉内移植自体骨髓细胞(BMCs)是治疗AMI及术后改善心功能的一种常见治疗方案，但因缺乏标准化BMC分离流程，导致该方案在临床上存在很多限制^[2]。研究显示骨髓来源的祖细胞群释放大量细胞因子、趋化因子和生长因子，其治疗机制为以旁分泌的途径促进组织保护和修复^[3]。该蛋白即为MYGDF。

　近年来，基因工程技术已发展成熟, 通过DNA重组技术可获得两个或两个以上基因嵌合重组后的表达产物，表达成功即获得融合蛋白。构建融合蛋白已经成为增加可溶蛋白的表达和纯化蛋白的方式^[4]—^[5]，通过构建融合蛋白还能延长蛋白质的半衰期。

MYDGF的结构

MYDGF蛋白由173个氨基酸组成，其中1-31位氨基酸为信号肽，32位氨基酸为非胰蛋白酶切割位点，32-173位氨基酸为该蛋白发挥其作用的主体，信号肽使得该蛋白在体内为分泌蛋白；Weiler等人预测位于第63 和92 位的两个半胱氨酸残基为二硫键。MYDGF由19号染色体开放阅读框（C19orf10）编码,Weiler等还预测C19orf10产物具有两个潜在的O-糖基化位点和8个潜在的磷酸化位点S33、S84、S132、S169、T36、Y61、Y67、Y119^2,[6] 。Korf-Klingebiel 等人发现C19orf10 成熟的分泌蛋白质含有142个氨基酸，理论相对分子质量为1. 58times;10⁴，含有一个31个氨基酸的N端信号肽，后面是一个信号肽切割位点。^[7]Abbas Akhdar 等人经BLAST搜索进行的局部序列比对以及HHpred法发现MYDGF与任何其他蛋白质均不具有序列相似性，MYDGF似乎是一种具有罕见结构特征的蛋白质。晶体结构学研究发MYDGF结构由10条反平行的beta;链组成，形成两个beta;折叠，两个beta;折叠面对面地堆积在一起，形成一个beta;三明治结构。beta;链通过3–18个氨基酸长度的环连接，并包围疏水内部。MYDGF的环结构高度不对称，短的发夹状环位于beta;-折叠的一端，而三个细长环（环5、7和9）则位于另一端。我们将保持细长环的区域称为顶面，将具有较短环的区域称为底面^[8]。

MYDGF的表达及分泌

具有趋化因子受体CXCR4的骨髓细胞可分泌MYDGF，该种骨髓细胞在AMI治疗中优先到达缺血组织并促进血管生成。Korf-Klingebiel 等证实了CXCR4^high的骨髓细胞是MYDGF的主要来源，并在AMI患者的血浆及心室梗死区中发现MYDGF 表达上调⁷。

研究发现，在其他细胞及组织中也存在MYDGF的表达。Tulin^[9]发现MYDGF在脾、心脏、肺脏、肝脏等组织中广泛表达，在休眠的CD8 、CD19 和单核细胞中也有表达；在淋巴细胞、NK细胞和间充质干细胞等非骨髓性癌细胞系中检测到了MYDGF^[10]；在肝癌细胞组织中C19orf10 蛋白表达与甲胎蛋白的表达显著正相关，并且在肿瘤上皮细胞的表达水平显著高于基质细胞^[11]。MYDGF可能在机体抵御炎症中发挥重要作用。

前文已提及MYDGF为分泌蛋白。研究发现MYDGF是通过旁分泌途径从细胞释放到体外。

MYDGF的作用

1. Mydgf具有抑制心肌细胞凋亡和促进心肌组织修复的作用

MYDGF在心肌细胞中激活PI3K/Akt通路，使Akt1磷酸化上调，并直接促进Bad，Bax的磷酸化，从而抑制受损心肌细胞的凋亡。在内皮细胞中，MYDGF通过激活MAPK1/3、STAT3通路和细胞周期蛋白D1信号通路促进血管内皮细胞增殖，诱导新生血管生成，降低心肌梗死的面积¹。

1. Mydgf具有改善小鼠2型糖尿病的作用

1.MYDGF改善2型糖尿病小鼠的糖脂代谢，促进肠道Ｌ细胞合成和分泌GLP-1

2.MYDGF通过促进肠道L细胞GLP-1相关基因的表达来增加L细胞合成和分泌GLP-1

3.MYDGF激活MEK/ERK和PKA/GSK3beta;/beta;-catein信号通路促进肠道L细胞合成分泌GLP-1。

1. Mydgf具有促进肝癌细胞增值的作用⁷

MYDGF融合蛋白的构建

蛋白质类药物在血浆中半衰期较短，往往需要大剂量给药才能达到好的治疗效果，不仅费用昂贵，还会造成严重的副作用，加重病人的负担。目前大概有六种融合方式来延长功能蛋白的血浆半衰期^[12]。

1. 通过基因融合一本身血浆半衰期较长的蛋白或蛋白结构域，如融合 Fc、白蛋白；

(2) 通过基因融合一惰性多肽-重组仿生 PEG 模仿物，如 XTEN（由 Ala、Glu、Gly、Pro Ser 和 Thr 6 种氨基酸组成的不同长度的肽链，无特定构象，称为 XTEN 序列）、

(3) 通过化学结合一重复化学部分增加流体半径，如聚乙二醇、透明质酸；

(4) 通过多聚唾液酸化增加负电荷，或直接融合带有负电荷的唾液酸肽，如绒毛膜促

性腺激素beta;链；

(5) 通过非共价结合具有生物活性的蛋白，如血清白蛋白、人IgG、转铁蛋白；

(6) 通过化学结合半衰期长的蛋白，如人 IgGs、Fc部分或 HAS 等。

本课题拟将MYDGF与Fc片段融合，构建融合蛋白，使MYDGF获得长效半衰期。Fc融合蛋白是通过基因工程等技术将具有生物学活性的功能蛋白分子与Fc片段融合得到的重组蛋白。

构建融合蛋白目前认为有两种方法，第一种是直接连接两个功能分子，功能分子包括蛋白质及其球形结构域和一些高表达的蛋白序列；第二种方法为利用连接肽序列连接功能分子。选择连接肽必须考虑其氨基酸组成和连接肽的折叠方式^[13]。连接肽的长度会影响蛋白质的折叠及稳定性。如果序列过短，可能会影响两蛋白高级结构的折叠，序列过长，连接肽可能存在免疫原性问题。大量研究表明连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的^[14]。常用于构成连接肽的氨基酸残基有Ala、Gly、Pro、Ser、Thr，其中Gly和Ser应用最多。目前我们仅能凭直觉设计连接肽，设计完一般会筛选多种连接肽序列，通过蛋白表达试验，从中选择表达活性最高的蛋白质所对应的连接肽¹¹。

Fc融合蛋白最主要的部分为Fc片段，Fc段与功能蛋白具有相对独立的结构域和功能，能够从不同角度影响融合蛋白的理化性质与生物活性。我们也可以在Fc段特异性结合Protein A，便于后续蛋白纯化。根据融合的Fc是否具有生物毒活性，可将Fc融合蛋白分为两类^[15]：非溶细胞性（Non-lytic）和溶细胞性（Cyto-lytic）。非溶细胞型只保留目标功能蛋白的生物活性和Fc 的长效血浆半衰期的功能，并不产生细胞毒性；溶细胞型则不仅仅具有以上功能，还具有生物毒性。

免疫球蛋白有5种，即IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。目前最常用的融合伴侣为免疫球蛋白IgG的Fc段，抗体Fc是抗体恒定区的一部分（包括铰链区-CH2-CH3，而不包括抗体恒定区的CH1部分）。人免疫球蛋白G有4个亚型，不同亚型的IgG的生物学活性有所差异。目前应用最多的是IgG1亚型抗体，近年来随着新适应症的拓展、新作用机制抗体药物的出现，细胞毒性较低的IgG2、IgG4亚型抗体得到重视。

融合蛋白的表达方式有两种选择，即真核表达和原核表达。由于Fc片段上有两个糖基化位点，原核表达不能糖基化修饰蛋白，因此表达蛋白应选用真核表达，常用宿主细胞为CHO细胞。真核表达系统可对翻译后的蛋白质进行修饰，使重组融合蛋白更接近天然蛋白质分子结构。且CHO细胞属于成纤维细胞，内源蛋白分泌较少，便于后续蛋白的纯化。目前载体的选择多为质粒。关于选用顺转还是稳转表达方式，还需考虑到蛋白表达产量的问题，可以同时进行顺转和稳转实验，从中选择产量高的。

小结

目前已有11种Fc融合蛋白被FDA批准上市，有43种FPs处于 II、III 期临床阶段，其中20种被确认可以延长目的蛋白的半衰期^[16]。可以看出Fc融合蛋白延长药物血浆半衰期的可行性以及Fc融合蛋白的发展前景良好。但是构建融合蛋白需考虑很多方面的因素，具体情况还需经过实验解决或调整，后续还需要考虑蛋白的纯化及产量等问题。

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学生签名： 年 月 日

指导教师意见：

指导教师签名： 年 月 日

所在教研室（实习单位）审查意见：

负责人签名： 年 月 日