开题报告
重组人CCL20蛋白的表达以及活性检测
- 课题的研究目的和研究意义
国家癌症中心在《国家癌症中心杂志》（Journal of the National Cancer Center）上发布了中国最新癌症报告《2016年中国癌症发病率和死亡率》。该报告根据全国肿瘤登记中心2016年收集汇总的相关数据整理分析，报告显示，2016年我国新增癌症病例约406.4万例。对于癌症疾病的研究，一直是国内药物研发的热点。
已有研究发现在多种肿瘤中表达CCR6，如结肠癌、胰腺 癌、原发性喉鳞状细胞癌等， CCR6 /CCL20的相互作用在肿瘤研究中主要是促进肿瘤细胞迁移、增殖及肿瘤免疫逃逸。CCL20可趋化 CCR6 细胞向抗原出现的组织部位定向迁移。CCL20 与 CCR6 相互作用时，iDC可被精确的趋化至抗原部位，通过摄取、加工并将抗原呈递给初始T细胞，激活机体的免疫反应。
趋化因子也称化学趋化性细胞因子( chemoattractant cytokines) ，是一组由组织细胞和炎性细胞产生的具有多种生物学功能的小分子生物活性肽，相对分子质量为8000-10000（含 70-100个氨基酸残基），其通过与靶细胞膜上的 G 蛋白偶联受体相结合，在生理和炎性环境下可介导白细胞在机体内定向迁移。趋化因子受体(chemokine receptors )，是一类具有 7 个跨膜区的G蛋白偶联蛋白，主要表达于内皮细胞和免疫细胞。
CCR6属 CCR类趋化因子，表达于未成熟 DCs、B细胞、CD4 T细胞亚群、CD8 T细胞亚群、NKT 细胞及多种肿瘤细胞。而趋化因子(C-C motif)配体20 (CCL20)是目前发现的CCR6在体内唯一的配体，表达于肝脏组织、皮肤角质上皮细胞和肠道上皮细胞等部位。而 CCR6 分布在 iDC、效应 T 细胞、记忆T细胞和B细胞表面，因此，CCL20 是一种能够召引 iDC 的趋化因子。
- 研究内容、研究目标及拟解决的关键问题
- 研究背景/研究目的与意义
在进行筛选CCR6的抑制剂的体外筛选实验中，我们通过外加CCL20的方式激活CCR6。为此我们购买了两种CCL20蛋白，一个是Ramp;D公司出售的CCL20 Protein, Mouse, Recombinant（NP_058656.1），是经过改造的突变体CCL20蛋白，其突变增强了CCR6的激活效果，导致抑制剂无法完全抑制CCR6的信号。另外一种是义翘神州公司出售的C-C motif chemokine 20_HUMAN，是一种野生型的CCL20蛋白，它可以激活CCR6，同时激活的CCR6也能被抑制剂抑制，但由于其活性较差，导致实验所需要的剂量大增，成本太高。综上所述，我们决定自己设计质粒，利用细菌表达系统制备人CCL20蛋白，以期获得高活性的CCL20蛋白。
- 研究现状
CCL20与CCR6结合后激发一系列的下游途径,参与各种恶性肿瘤的发生、发展，且与多种炎症疾病的机制有关联。近年来国内外对 CCR6 /CCL20 功能及其在体内的作用进行了大量研究，现在 我们对趋化因子受体 CCR6 及其配体 CCL20 在炎性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤领域的研究展开简单的综述。CCL20 生理条件下表达较低的基础水平，但是可经强烈的促炎信号诱发其表达升高，如主要细胞因子 TNFalpha;、 来源于细菌的 Toll 样受体激动剂。
分子克隆是实验室最基础也是最重要的实验技术。分子克隆是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定 DNA 片段的方法。也就是用体外重组的方法将目的基因插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化或转导的方式，引入适合的受体细胞内，使目的基因得到复制与扩增，然后再从筛选后的受体细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入 DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增，并使宿主细胞获得新的遗传特征。
