血小板膜修饰基因递药系统的研究
- 循环肿瘤细胞（CTC）及其靶向研究
循环肿瘤细胞是外周血中由肿瘤原发灶或转移灶释放入血液中、具有肿瘤特异性抗原或基因特征的肿瘤细胞。同时也是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，大部分循环肿瘤细胞在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并逐渐发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。大量研究表明，CTC以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团（CTM）。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生上皮-间质转变（EMT），故CTC存在不同类型，包括上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮细胞与间质细胞混合表型。CTM和间质细胞表型CTC具有更强的转移潜能。癌症导致死亡的主要诱因是癌症转移和扩散，检测癌症患者的血液，可以发现其中有循环肿瘤细胞。相关研究认为循环肿瘤细胞具有一种值得关注的特性，即一定的肿瘤干细胞特性：能够自我更新、分化和侵袭，并且具有高抗凋亡性和高转移性。从而，得到一个结论：减少体内循环肿瘤细胞含量尤其是血液中的循环肿瘤细胞含量在抑制肿瘤的扩散和转移方面具有重要作用。但是，在病人体内，相对于其他血细胞来说，循环肿瘤细胞数量极少，一般情况下循环肿瘤细胞与血细胞比例为1:10000000000，并且这些循环肿瘤细胞可能处于失巢凋亡状态，这就为在血液中靶向循环肿瘤细胞提供了巨大挑战，同时也体现了靶向到血液中循环肿瘤细胞的必要性。
对于CTC的靶向研究，目前主要集中于根据CTC表面的特异性蛋白来构建靶向制剂，从而达到选择性俘获CTC的目的。虽然多种靶向CTC的策略均能够特异性识别CTC，但缺乏一种通用的靶向策略可以适用于各种癌症的循环肿瘤细胞。并且，值得关注的是，一些非癌症疾病也会诱导产生与CTC具有相同类型蛋白的循环上皮细胞，利用上述靶向策略可能会出现靶向错误。因此，开发具有通用性和特异性的CTC靶向策略具有重要意义。
- CTC与血小板的相互作用
1865年法国临床医生Armand Trousseau观察发现移动性血栓静脉炎与恶性肿瘤的发生具有相关性，由此首次发现血小板与恶性肿瘤间的联系。近些年来，大量的研究指出，活化的血小板与CTC间的相互作用是肿瘤转移重要过程。大量侵入血管中的CTC将会快速的被免疫系统和血流剪切力所破坏。血管中残留的CTC可通过表达特异性的血小板激活蛋白如平足蛋白、MMP-2和组织蛋白酶-2等直接激活血小板，或者通过释放可溶性的因子如ADP、半胱氨酸蛋白酶或者激活凝血级联反应产生凝血酶等来诱导血小板活化并在CTC表面聚集。血小板在CTC表面的聚集可保护CTC免受溶细胞性自然杀伤细胞（NK）的攻击。 NK细胞介导的杀伤CTC过程需要直接与CTC接触，然而，CTC周围的血小板理论上可阻止CTC和NK细胞间的接触，从而使CTC逃离内源性免疫系统的监控。另外，聚集于CTC表面的活化血小板可分泌促进CTC的上皮向间质转化（EMT）相关因子,如通过分泌TGF-beta;，激活TGF-beta;/ Smad及NF-kappa;B通路。此外，激活的血小板能分泌促血管生成因子如VEGF-A和PDGF等，同时也可分泌蛋白酶如MMP-2和MMP-9等，从而影响肿瘤血管生成、基质降解、肿瘤细胞转移和侵袭。基于血小板和CTC的特异性相互识别和相互吸附作用，可利用血小板作为靶向血液CTC的药物载体，可作为一种通用型的靶向CTC策略。
- 血小板膜修饰的纳米粒载药系统
近年来，纳米技术被广泛应用于诊断、治疗等生物医学领域。其中应用纳米技术制备的纳米载药系统一直是药剂学研究的热点领域。然而，纳米粒进入血液后易被人体免疫系统中的网状内皮组织或单核吞噬细胞识别并清除。而且，当纳米粒暴露在体液中时，一些非特异性的蛋白质和生物分子较易黏附到纳米粒表面，形成一种蛋白质环（proteincorona）结构。这种结构很大程度上干扰了纳米粒与生物系统之间的相互作用，并且加快了纳米粒被免疫系统清除的速度。理想的功能性纳米粒应具有稳定的结构和较长的体循环时间，从而尽可能多地到达靶点。此外，还应使用安全性高、不易被免疫系统识别的材料制备纳米粒。以上种种要求限制了纳米粒在临床上的应用。在新型药物传递载体的研究过程中，人们尝试用新型仿生材料对纳米粒进行伪装，使纳米粒成为自体物质从而避开免疫系统的识别。在众多仿生材料中，细胞膜是一种可赋予纳米粒独特生物学性质的材料。通过将细胞膜融合于纳米粒表面，可使纳米粒具备原细胞复杂而独特的表面理化性质。这种直接将细胞膜与纳米粒结合的方法，不仅可减少体内非特异性蛋白质对纳米粒的吸附，而且制备工艺相对简单。目前，文献报道中修饰纳米载药系统的细胞膜种类有血细胞（包括红细胞、白细胞与血小板）、干细胞、细菌及肿瘤细胞等。由此，我们相信血小板膜也可以被用来修饰纳米粒载药系统。
- CTC与乏氧诱导因子-1alpha;（HIF-1alpha;）
乏氧诱导因子(HIF)是乏氧应答中起重要作用的转录因子，一直是乏氧研究的焦点。HIF由alpha;亚基和beta; 亚基组成，alpha;亚基包括HIF-1alpha;、HIF-2alpha;和HIF-3alpha;，其中alpha;亚基因诱导条件不同通过选择性剪接产生不同变体。beta;亚基包括ARNT、ARNT2 和ARNT3。研究表明在HIF-1中, 亚单位HIF-1alpha;对氧的依赖性较强, 当周围环境的氧浓度下降时，HIF-1alpha;表达增加，并且其表达增加表现在多个水平上，包括转录和蛋白等水平，但主要是蛋白水平表达改变。HIF-1alpha;可作用于多个环节促进肿瘤转移。基质降解方面：肿瘤细胞侵袭转移能力与其产生或诱导MMPs的能力密切相关，HIF-1可引起MMPs的表达增加，进而促进恶性肿瘤的转移；细胞黏附方面：HIF-1alpha;可通过对肿瘤细胞黏附分子表达的影响而促进肿瘤转移；血管生成方面：乏氧能引起VEGF表达的上调，在肿瘤发生早期向血管生成型转变过程中，HIF-1alpha;介导了VEGF的上调；细胞凋亡方面：HIF-1alpha;上调凋亡抑制因子Bcl-2, 抑制凋亡, 从而增强肿瘤转移力。另外，HIF-1alpha;亦可上调凋亡抑制因子p21, 从而抑制凋亡使肿瘤恶性程度增加易于转移。已有研究报道，在乳腺癌转移患者血液中分离所得的CTC中发现HIF-1alpha;表达增高的现象，推测其原因可能是由于CTC外表面所包裹的血小板阻挡可氧气的传送，造成CTC核心乏氧的微环境。基于HIF-1alpha;在癌症转移中的多种作用，提示抑制CTC产生HIF-1alpha;可能是治疗癌症、减少癌症转移的一种新途径。
- 本课题的设计思路
基于CTC在癌症转移中的重要性，以及CTC对血小板的诱导聚集作用，针对靶向清除血液中CTC，抑制癌症转移的关键科学问题，本项目选择血小板膜作为药物靶向递送的载体。
血小板是血液中的一种凝血细胞，直径为2.0-5.0mu;m，无核，外观为盘状。血小板在血液中是仅次于红细胞的第二丰富的血细胞，其个数约为150-350times;109个/L。血小板由骨髓中巨核细胞所生成，人类每天产生大约200times;1012个血小板，进入循环后的血小板其生存期为8到10天，凋亡的血小板将会在脾脏清除。
