光致增敏型两性离子纳米载体用于紫杉醇递送的体外细胞学评价
一：文献综述
- 研究背景
近年来，肿瘤疾病发病率逐年增高，恶性肿瘤已经成为全球第一致死疾病，严重威胁人类的身体健康。紫杉醇作为一种有效的抗肿瘤化疗药物已成为科学研究的热点药物，然而，其较差的水溶性和较严重的毒副作用限制了其使用。近年来，多功能纳米载体、胶束、脂质体等新剂型的发展对于改善紫杉醇药物的溶解性和安全性具有重要的意义。两性离子载体修饰之后的纳米制剂更是具有良好的抗蛋白吸附功能，能够更好地发挥药物疗效。光动力疗法是目前新兴的治疗肿瘤的方法，将光动力疗法运用于紫杉醇能够更好的发挥而且的抗肿瘤作用。
- 紫杉醇及其纳米制剂的研究发展
紫杉醇是由美国化学家Wani和Wall在1963 年从一种生长在美国西部的太平洋杉树皮和木材中分离得到的一种紫杉烷类二萜化合物，具有高度的亲脂性和较差的水溶性，具有显著的抗肿瘤活性。其抗肿瘤活性原理如下：紫杉醇能与微管蛋白结合后能形成稳定的微管束，并使之解聚，将癌细胞的生长停止在G2晚期和M期，通过抑制细胞复制阻止癌细胞增殖[1]。然而作为抗肿瘤药物，紫杉醇溶解性差且毒副作用较高。近年来多功能脂质体、胶束、纳米粒等新型制剂的应用能够有效地改善药物的溶解和降低药物的毒副作用。例如Wang 等[2]在聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺( PEG-PE) 胶束表面修饰以乳腺癌细胞 MCF-7 特异性噬菌体蛋白，制成紫杉醇的胶束纳米粒，体内外试验表明该纳米制剂对肿瘤细胞有较强的选择性，不仅能够有效增强肿瘤细胞的凋亡，抑制其增殖，而且未见肝毒性和其他重要器官的病理学变化[3]；Zhang 等[4]采用改良溶剂蒸发法制备了 DTX 的新型脂质乳化纳米粒( DTX-LPNPs) ，以脑磷脂作为乳化剂，代替了单一化学乳化剂聚乙烯醇(PVA) [5,6] ( 脑磷脂的乳化效率是 PVA 的 20 倍) ，DTX-LPNPs 兼具纳米粒和脂质体的优点，不仅可以控制药物释放，还能增强吸收和生物相容性。 体外释药呈现缓慢持续的特性，延长了药物的半衰期[7]。
- 纳米制剂表面修饰材料
紫杉醇的纳米载体所运用的材料比较广泛，包括多功能修饰的高分子材料、脂质体、无机材料等。聚乙二醇（PEG）作为最常见的修饰基团，具有良好的安全性和水溶性。不同分子量的PEG具有不同的状态和特性， 这一特性增加了PEG修饰基团使用的灵活性。药物载体表面经PEG修饰之后不仅能够改善载体的溶解性及生物分配行为，而且能够提高载体稳定性，减少降解，从而延长载体血液循环时间。 Amoozgar Z等[8]设计了用聚乳酸－羟基乙酸共聚物（PLGA）包裹紫杉醇的纳米粒，并用一层聚多巴胺及一层PEG修饰其表面，该纳米粒相比于线性PLGA-PEG 共聚物形成的纳米粒载药量提高了3.8倍，且体内外试验显示该纳米粒可持续释放紫杉醇， 腹腔给药低剂量纳米粒，可提高耐药卵巢癌小鼠的存活率且无明显的系统性毒性[9]。然而，最近的研究表明，PEG也存在一些缺点，一是PEG不稳定，在体内易氧化，不能起到抗蛋白作用；二是PEG具有ABC效应，即在多次应用PEG后，PEG的免疫原性会引起明显的体液免疫反应，导致PEG修饰的载体会被吞噬细胞识别和清除，大大降低作用效果；三是PEG在高温下易脱水而失去抗蛋白非特异吸附性能[10]。这些不足都限制了PEG材料的应用。两性离子聚合物如磷酸胆碱类、甜菜碱及其衍生物具有良好的生物相容性，化学稳定性和热稳定性，能够克服PEG热不稳定和易氧化的缺点，因此可作为新型抗非特异性蛋白吸附材料，替代传统的PEG类聚合物的 [11]。与PEG相似，两性离子也呈电中性，但两性离子聚合物不仅提供了空间阻隔效应，且其表面强静电水合能力具有更好的抗蛋白吸附性能[12,13]。
- 光动力疗法及光敏剂的研究发展
光动力学疗法（Photodynamic therapy，PDT）是一种利用光敏药物和激光活化治疗癌症的新兴方法。光动力疗法用于治疗肿瘤疾病的三要素分别是光敏剂、光和分子氧，这三者相互作用，缺一不可。光敏剂是能吸收和重新释放特殊波长的卟啉类分子，具有四吡咯基结构。理想的光敏剂应该具有成分单一，稳定性高，暗毒性小，光毒性强，较高的活性氧产率，选择性好，长波吸收等特点[14]。第一代光敏剂是血卟啉衍生物（HPD）、二血卟啉醚（DHE）和光敏Ⅱ（Photofrin Ⅱ）等，一般为混合制剂。第一代光敏剂具有很多缺点，一是它们大多都需要四周以上的避光时间；二是它们多数在体内滞留时间长，排泄缓慢，因此有更大的几率产生毒副作用；三是它们的最长激发波长在630 nm，此波长的组织穿透能力差，因而限制了在较大组织上的应用[8]。第二代光敏剂是包括卟啉衍生物、中介取代芳基卟吩（一氢卟吩）类、酞菁类、叶绿素a降解产物的衍生物在内的五大类。第二代光敏剂是目前实验研究和临床使用应用最广泛的光敏剂，它改善了第一代光敏剂的部分缺点，如它的作用波长较长因而增强了其穿透组织的能力。第三代光敏剂是指将靶向技术如脂质体、胶束、纳米载体等应用在第二代光敏剂上，不仅能够具有更高的靶向选择性还能提高光敏剂的稳定性和光敏剂激发光的照射深度[15]。光动力疗法治疗癌症的原理是肿瘤组织选择性吸收光敏剂，特定波长的激发光照射穿透组织激发光敏剂，激发态的光敏剂把吸收的能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡。然而，光动力学疗法的有效性常常受肿瘤细胞供氧不足的限制[16,17]：由于肿瘤细胞快速增值的特性，其耗氧量远多于正常细胞，肿瘤区经常处于缺氧状态，因此针对部分肿瘤区的光动力学疗法的疗效并不理想[18]。目前，很多研究都致力于解决这一问题。Wang等人[19]研究了一种基于血红蛋白氧气载体体系，将血红蛋白和三嵌段共聚物通过化学作用共轭结合，共轭后的血红蛋白的养结合能力和抗氧化活性能够补偿活性氧的氧需求量。
- 光敏剂与化学药物的联合使用
光动力疗法与化学药物紫杉醇联合使用，能够更好地发挥抗肿瘤作用。将光敏剂应用于紫杉醇纳米载体中，在体外近红外(NIR) 光照射刺激下，光敏剂将产生发挥细胞毒性的活性氧物质 ，导致肿瘤细胞凋亡和坏死，使用光动力疗法辅助可提高治疗效果[20]。光动力疗法和化药联用不仅可以促进化药释放从而增强抗肿瘤效应，而且操作方便，创伤小，患者顺应性好。可以将光敏剂IR780运用于光动力治疗，也可将近红外光转化为局部热量发挥光热治疗作用[21]。Deng 等[22]设计了白蛋白和氧化石墨烯双载体包载紫杉醇，将光热治疗和化疗作用联合起来同时作用增强抗肿瘤功效和抑制肿瘤复发。这种载体在近红外光照射下可发生光热效应，不仅能促进药物释放，还能够在肿瘤局部升温有利于杀死肿瘤细胞[23]。
二：实验目的及意义
- 在细胞水平考察光致增敏型两性离子纳米载体的摄取以及转运行为
- 在细胞水平评价光致增敏型两性离子纳米载体释放药物的效率
- 在细胞水平考察用于紫杉醇递送的光致增敏型两性离子纳米载体制剂的体外药效
三：实验内容
- 完成光敏型紫杉醇纳米制剂的制备
- 完成紫杉醇纳米制剂在细胞内的转运机制的考察
- 完成制剂在胞内触发释药速率和机制的考察
- 完成制剂在体外细胞毒、凋亡等药效学评价
四：参考文献：
