原代肝细胞分离和培养
一、课题来源及研究的目的和意义
肝脏是生理和病理状态下能量代谢、毒素的生物转化以及血浆蛋白合成的中心器官，是机体最重要的器官之一。肝细胞既能高度分化，又能很快进入细胞周期而增殖。尽管肝细胞在体内拥有相当强的增殖能力，但要肝细胞在体外保持分化状态且能继续增殖却非常困难。要明确影响肝细胞生长、分化和死亡的因素、有关的激素、营养因素、细胞外基质以及肝细胞和存在于肝脏的非实质细胞间的相互作用等，仍然面临认识水平和技术的挑战。
近年许多学者在肝细胞的原代培养领域做了大量的探索，提出了一系列有效的原代肝细胞分离和培养的方法，为肝病研究提供了方便。在细胞分离的基础上进行细胞培养，是研究肝脏生理和病理的基础。细胞培养[1]一般可分为原代培养和传代培养。传代培养是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。而原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。因此，学习原代肝细胞的分离和培养，可以为以后研究肝细胞体外模型奠定基础。
当肝脏遭到各种致病原侵袭时，引起肝脏损害与炎症反应，肝组织免疫系统同时被激活，进行组织修复。肝纤维化[2]是指这种组织修复过程、过度及失控时，肝组织内细胞外基质过度增生与异常沉积所致肝脏结构和肝功能异常改变的一种病理过程。轻者称为肝纤维化，重者使肝小叶结构改建，假小叶及结节，成为肝硬化。若不及时治疗和调养，将有可能转变为肝癌。肝纤维化作为慢性肝病的过渡阶段，它的研究对肝病的治疗有重要意义。但肝纤维化动物模型周期长，死亡率高，因此要建立周期短易于操作的体外细胞模型[3]。常规实验室常用的肝细胞有L02细胞、HSC-T6细胞、HepG2细胞等，这些都是可以无限传代的细胞系。原代肝细胞模型是药效筛选、毒性筛选、药物代谢与生物转化、药物相互作用、药物致癌性检测的理想模型, 为新药研究提供重要的参考资料, 提高了新药研发的效率。随着实验方法和实验技术的不断成熟, 原代肝细胞在药物研发中将有着更加广泛的应用。
在各大肝脏疾病中，由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的乙型肝炎，已经严重危害了人类的健康。要对乙肝的发生、发展进行机制研究就需要原代肝细胞作为工具。长期稳定地大规模体外培养活力旺盛、功能良好的肝细胞在诸如肝细胞移植、基因治疗、药物毒性评价及药代动力学研究等方面具有广泛的用途。因此，肝细胞的分离、培养技术受到了越来越多的关注。近年来，许多学者在原代肝细胞分离和培养技术上做了大量的探索，为肝细胞分离、培养技术的实际应用提供了大量的技术支持。
二、国内外常用研究方法及现状
肝细胞是肝脏最主要的实质细胞，正常生理状况下占60%[4]。肝细胞完成肝脏的绝大部分功能，是肝脏的主要效应细胞，同时也是生物及化学损伤的主要靶点。
肝细胞的分离和培养技术在HBV感染模型的建立、生物人工肝的运用以及许多相关生命科学领域的研究中发挥着十分重要的作用。常用的分离和培养方法如下。
