课题名称 高聚原花青素降解新方法课题性质 radic;基础研究应用课题 设计型 调研综述 理论研究开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）一、研究背景原花青素，是广泛存在于植物的皮、壳、籽、花和叶中一类多酚化合物的总称，基础结构由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，根据聚合度大小一般分为低聚原花青素（聚合度为2~5）和高聚原花青素（聚合度gt;5）。
研究发现原花青素具有很强的抗氧化、消除自由基、稳定维生素C的作用，临床应用于改善血液循环、提高视力、消除水肿、降低胆固醇、增强记忆力和免疫力等临床研究，同时原花青素具有很好的安全性，也常用于保健品和美容护肤产品中。
原花青素具有良好的利用价值，所以近年来被热切关注，一般植物体如山楂和葡萄籽中提取出来的原花青素为高聚原花青素，即生物大分子结构，低聚原花青素提取含量只占10%~20%，但人体吸收生物大分子能力有限，仅低聚原花青素能被人体很好的吸收，利用率低下，所以开发植物中大量的高聚原花青素转化为低聚原花青素或者转化为具有同等利用价值的生物活性小分子成为更好利用原花青素的突破。
[1] 目前，由于高聚原花青素组成和结构的复杂性，高效分离高聚原花青素及准确测定其分解产物及聚合度仍是一个技术难题，通过文献查阅及整理，列出目前几种主要分析高聚原花青素的方法：[2]1)盐酸-正丁醇法（Bate-Smith法）：原花青素在无机酸及加热条件下降解，酸解使碳-碳键断裂，产生红色花青素，产物在550nm处有最大吸收，测定其吸光度，加入正丁醇抑制了副反应，此法简单且具有专一选择性，但是此方法以选定的原花青素作为指标，是相对标准，实际使用时不足以测出真实含量；2)Porter法：在盐酸-正丁醇法上进行改良，加入Fe3 以稳定反应体系，分析的结果建立一个PVU（porter value unit）值表示，方法的重现性和灵敏性较之得到提高，但是此法不能明确提取物中高聚原花青素含量还是原花青素含量，所以无法定量分析；3)香兰素法：利用原花青素中含有的间苯三酚、间苯二酚能在酸性条件下与香兰素发生缩合反应，根据生成物的颜色可以判定黄烷醇的含量高低，但此法特异性不高，且影响因素较多；4)钨钼酸法（Folin-Ciocalteau法）：此法的原理为酚类化合物在碱性条件下可以将钨钼酸中W6 还原为W5 ，生成蓝色溶液且颜色深浅与含量多少成正比，测定最大吸收，可以以没食子酸为参比，结合HPLC测定单体的含量，但此法干扰因素也比较多，特异性不强； 此外，提取纯化高聚原花青素的方法还有CO2超临界萃取法、超声波提取法、酶提取法或上述几种方法经过改良或者与HPLC、核磁、质谱联用也可提高分析的准确度；在本次研究中，高聚原花青素的降解方法采用硫解法初步分离葡萄籽提取物，得到苄硫醚衍生物和末端黄烷醇分子，随后用乙酸乙酯水溶液进行萃取，分离出黄烷-3-醇苄硫醚衍生物，采用薄层色谱进行成分的初步鉴定，而后采用硅胶柱色谱层析分离，辅以薄层色谱进行再次鉴定，结合HPLC测定含量；原花青素在酸解条件下生成的碳正离子中间体，与苄硫醇亲核试剂反应生成4-取代衍生物，苄硫醇和高聚原花青素反应产物简单，一部分形成黄烷醇分子，一部分为黄烷醇的4-苄硫醚衍生物，经过硫解后复杂的成分被除去，剩余的主要的儿茶素，表儿茶素和苄硫醚衍生物，此法简单易操作，而且能通过单体和衍生物的摩尔数估算样品的平均聚合度。
[3]二、实验方案设计及调节实验过程大致可以分为四步：1.硫解反应反应式如下：实验操作：精确称取2g葡萄籽提取物，加入60ml甲醇完全溶解，得到的葡萄籽-甲醇混合溶液，加入等量的3.3%盐酸甲醇溶液和3ml苄硫醇，在90℃条件下回流水浴60min，冷水立即冷却后，减压蒸馏（水泵0.1MPa真空度下）（蒸馏至剩余液体量大概为10-20ml），得到的产物用乙酸乙酯水溶液（乙酸乙酯：水=1:1）萃取（萃取的乙酸乙酯和水的比例可能需要调整），萃取三次（根据萃取情况调节萃取次数），每次10ml乙酸乙酯水溶液，收集乙酸乙酯相中的部分，得到苄硫醚衍生物。
实验根据具体情况进行调整，先以薄层色谱鉴别，若硫解不彻底，可以调整苄硫醇的浓度，根据文献查询，苄硫醇浓度为0.4mL/L能得到较好的硫解，按照上述方法，溶液中苄硫醇浓度为25mL/L，浓度较大，可增加酸的量；或者酸液可以改成冰醋酸：0.1M盐酸（5:1，V/V)，尝试优化。
[3]实验仪器：分析天平，称量纸，旋转蒸发仪，恒温水浴锅或电炉，1000ml烧杯，100ml烧杯，50ml烧杯，玻璃棒，分液漏斗，铁架台，250ml圆底烧瓶，冷凝管，温度计；实验试剂：葡萄籽提取物，甲醇，3.3%盐酸甲醇溶液，苄硫醇，蒸馏水，乙酸乙酯；2.薄层色谱法TLC进行鉴定[4]采用硅胶薄层色谱法进行成分鉴定，薄层：硅胶GF254制备的薄板；展开剂：V（甲苯）：V（丙酮）：V（盐酸）=3:3:1；显色剂：10%香草醛的盐酸溶液（红色斑点）；实验操作：制备展开剂100ml（30mL甲苯 30mL丙酮 10mL盐酸），置于层析缸中，点样，在距离薄板底端2.0-2.5cm的位置轻划一条线，大致选好3-4个间距相等的点，毛细管点样，点样量15ul，将点好样品的薄板放入展开室中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5-1.0cm，密封室盖，准备显色剂，待展开剂展开至一定距离（一般为10-15cm）后取出薄板，喷显色剂显色鉴定条带斑点颜色和数量。
实验仪器：层析缸，薄层板，毛细管，100mL烧杯；3.硅胶柱色谱初步分离硅胶柱色谱进行化合物分离，固定相：硅胶；流动相：70%丙酮，流速控制：0.5mL/min；实验操作：将干净干燥的色谱柱垂直固定到铁架台上，取少量脱脂棉用洗脱液轻轻吹洗至底部，均匀加入硅胶，在桌子上小幅度振荡至松密适宜，加入洗脱液至充满整个柱子及硅胶上方5-8cm处，其中，硅胶和洗脱液的加入都要均匀平稳不可断开，打开色谱柱下方胶管的活塞，控制流速平稳，注意随时添加洗脱剂，将萃取后溶液加入，收集流出的液体，每10mL一瓶收集至全部洗脱。
实验仪器：色谱柱，硅胶，漏斗，烧杯，25mL容量瓶4.薄层色谱法TLC再次检测再次利用薄层色谱法对层析法分离的溶液进行鉴定，根据比对斑点位置，将含相同成分的溶液合并，得到最终需要检测的几份溶液，展开剂等同上述方法。
5.HPLC分析取层析分离后的产品进行HPLC质量分析，关于质量分析方法有待于改进和补充；暂拟色谱条件：流动相：0.05%甲酸水溶液；流动相B：V（乙腈）：V（甲醇）=2:1；梯度洗脱程序（min/B%):0/6%,4/50%,6/55%,7/100%,8/100%,9/6%,15/6%;柱温：35℃；流速：0.2ml/min；进样量：20uL；检测波长：280nm；定量：峰面积外标法；三、预期成果硫解法用TLC检测时应该出现四个条带或者斑点，证明硫解法分解高聚原花青素比较完全，用硅胶柱层析分离降解产物，最终收集应该为4-5份不同的溶液，测出硫解产物四种单体儿茶素，表儿茶素，没食子酸，表儿茶素没食子酸酯和相应的苄硫醚衍生物表儿茶素-4-苯甲硫醚，表儿茶素没食子酸酯-4-苯甲硫醚的含量，及计算聚合度（聚合度的计算方法：已知mDP(Degree of Polymerization)=Mol[单宁单元]/Mol[末端单元]或mDP=（Mol[前端和中间单元] Mol[前端和中间单元]）/Mol[末端单元]）又或mDP=Mol[单宁单元]/（Mol[单宁单元]Mol[前端和中间单元]））[5]四、实验安排三月份：第一、二周：查找文献，基本敲定实验详细流程，确定实验条件，进行硫解和薄层色谱分析；第三、四周：优化实验细节，改进硫解条件，较好分离出表儿茶素等单体；四月份：确定后续液相的分析和质量分析器，聚合度的计算等，基本过一遍实验流程，，完成中期报告；五月份：再次熟悉实验流程，验证偶然性和突然性，开始完善毕业论文。
